發(fā)布時(shí)間：2018-02-03 01:53

  本文關(guān)鍵詞： 吡啶并咪唑類化合物 CDC25抑制劑 細(xì)胞周期阻滯 CDC25 細(xì)胞凋亡　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 全世界每年死于癌癥的病人數(shù)以千萬計(jì),癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康和生存。雖然每種惡性腫瘤可能由不同的病因引起并具有不同的癥狀,但是它們最重要的共同特征就是腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。而細(xì)胞增殖又需要通過細(xì)胞周期來進(jìn)行調(diào)控。在細(xì)胞周期調(diào)控中起著核心作用的是CDK/Cyclin復(fù)合物,CDK/Cyclin的活性受多種因子的調(diào)控,如Weel,CDC25等。CDC25是一種雙特異性蛋白磷酸酶,它可以去磷酸化CDK/Cyclin復(fù)合物從而使其活化,參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)并調(diào)控應(yīng)對(duì)DNA損傷,在正常的細(xì)胞周期中具有重要的作用。近來很多研究表明,CDC25在多種癌癥組織中均呈現(xiàn)過表達(dá),如結(jié)腸癌,肺癌,胃癌,乳腺癌,前列腺癌,肝癌等等,其過表達(dá)往往與腫瘤生成及癌癥的預(yù)后不良有關(guān)。由于CDC25對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用以及在癌細(xì)胞中的異常表達(dá),它已成為一個(gè)熱門的癌癥治療靶點(diǎn)。 近年來,許多類型的化合物被發(fā)現(xiàn)并證明在體外具有抑制CDC25磷酸酶活性的作用。這些化合物主要是以維生素K3及其衍生物為代表的醌源類化合物,另外還有喹啉二酮類化合物及萘醌類化合物等等。它們共同的特征是具有醌類結(jié)構(gòu),在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可以誘導(dǎo)G1/S期和G2/M期的細(xì)胞周期阻滯。但是它們的效價(jià)可能因?yàn)轷�原酶而降低,并且嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性也限制了其開發(fā)潛力。故開拓思路、尋找新結(jié)構(gòu)、新代謝途徑的CDC25抑制劑勢(shì)在必行。 雜環(huán)化合物在有機(jī)藥物中占有重要地位。大量的、結(jié)構(gòu)多樣性的雜環(huán)化合物的合成是發(fā)現(xiàn)具有生物學(xué)功能的化合物的源泉,尤其在抗腫瘤新藥發(fā)現(xiàn)中具有重要的地位(宋宇寧,等,Curr Pharm Des.2013;19(8):1528-48.)。通過對(duì)近幾年文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),芳雜環(huán)巰乙酸衍生物是具有廣泛的生物活性的優(yōu)勢(shì)雜環(huán)結(jié)構(gòu),引起了我們的研究興趣(宋宇寧,等,Med.[Chem.Commun.2013;4:810-816;宋宇寧,等,Curr Pharm Des.2013;19(40):7141-54.)。它們可以作為構(gòu)成藥效團(tuán)的基本結(jié)構(gòu)母核,通過剛性雜環(huán)及柔性巰烷鏈的協(xié)調(diào)匹配以適合藥物特殊作用靶點(diǎn)的空間要求；還可以作為活性取代基或環(huán)系的組成部分而產(chǎn)生相應(yīng)的生物活性；同時(shí)具有較好的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性及生物相容性。因此它們近期被廣泛應(yīng)用于新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)優(yōu)化。 根據(jù)上述分析及我們近幾年在該類雜環(huán)化學(xué)及生物學(xué)方面的研究基礎(chǔ),為發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的CDC25抑制劑,構(gòu)建了含有60余個(gè)雜環(huán)巰基烷烴衍生物的小型化合物庫,并對(duì)其進(jìn)行活性篩選,發(fā)現(xiàn)嘧啶并咪唑巰乙酮類及嘧啶并咪唑巰乙酰胺類化合物這兩大類結(jié)構(gòu)具有較好的抗腫瘤活性,根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn),推測(cè)其可能是潛在的CDC25抑制劑。本文對(duì)篩選出的6個(gè)化合物(CHEQ-1～CHEQ-6)進(jìn)行了進(jìn)一步的活性測(cè)定,對(duì)其中藥效最為顯著的CHEQ-2(1-(3,4-二羥基苯基)-2-(1-(2,4,6-三甲基苯)-1H-咪唑[4,5-c]吡啶-2-巰基)乙酮),探討了其對(duì)MCF-7、HepG2及HT-29三種細(xì)胞的體外抗腫瘤活性及其機(jī)制,并對(duì)其安全性及體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。 研究目的： 本研究對(duì)6個(gè)新型吡啶并咪唑巰烷類化合物進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)其中活性最佳的CHEQ-2的抗腫瘤活性進(jìn)行進(jìn)一步的研究,探討其作用機(jī)制,對(duì)發(fā)現(xiàn)高效低毒且具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型CDC25抑制劑具有重要意義. 實(shí)驗(yàn)方法： 以O(shè)MFP為底物測(cè)定體外CDC25的磷酸酶活性,評(píng)價(jià)該系列化合物對(duì)CDC25A和CDC25B體外酶活性的抑制作用。選用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和人肝癌細(xì)胞HepG2,以MTT法檢測(cè)了該系列化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。對(duì)篩選出的活性較好的CHEQ-2,進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)其它多種不同類型腫瘤細(xì)胞生存率的影響,并與陽性化合物VK3以及XDW-1進(jìn)行比較。用PI染色配合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CHEQ-2對(duì)MCF-7、HepG2以及HT-29的細(xì)胞周期的影響,并用Western blotting法對(duì)周期相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Hochest33342染色法和流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)測(cè)定CHEQ-2對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,PARP,Bax以及Bcl-2的表達(dá)。 用DCFH-DA染色和JC-1染色分別測(cè)定MCF-7、HepG2以及HT-29細(xì)胞中ROS和線粒體膜電位的變化,并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量分析。用抗氧化劑NAC預(yù)處理細(xì)胞后再加入CHEQ-2進(jìn)行作用,檢測(cè)合用后ROS水平、線粒體膜電位的變化以及細(xì)胞生存率。 一次性灌胃或腹腔給予小鼠2000mg/kg的CHEQ-2,觀察2周內(nèi)動(dòng)物的急性毒性反應(yīng)及體重變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn),將HepG2細(xì)胞接種于裸鼠腋下,檢測(cè)CHEQ-2對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,進(jìn)一步用Western blotting法檢測(cè)了CHEQ-2對(duì)腫瘤組織中CDC25A、CDC25B、CDK2、Cyclin A、Cyclin B以及Cyclin E的調(diào)控作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 該系列6個(gè)吡啶并咪唑類化合物對(duì)CDC25A和CDC25B的體外酶活性均具有一定的抑制作用,同時(shí)也在HT-29和HepG2細(xì)胞中表現(xiàn)出的良好的抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用。其中,CHEQ-2的酶抑制活性及抗腫瘤活性最佳,它可以抑制多種不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖,IC50值低于VK3和XDW-1。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CHEQ-2可以下調(diào)CDC25A/B CDK2及Cyclin A、B、E的表達(dá),誘導(dǎo)MCF-7、HepG2和HT-29細(xì)胞中的細(xì)胞周期阻滯,將細(xì)胞阻滯在S期。被阻滯在S期的細(xì)胞比例可達(dá)66.9%、63.7%及61.6%。 CHEQ-2還可以誘導(dǎo)MCF-7、HepG2和HT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡.Hoechst33342染色顯示,經(jīng)CHEQ-2處理48h后,細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的固縮濃染,有的細(xì)胞核甚至出現(xiàn)碎裂呈珠鏈狀的現(xiàn)象。通過Annexin V/PI雙染法定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CHEQ-230處理組對(duì)三種細(xì)胞均作用顯著,細(xì)胞凋亡率最高可達(dá)49.5%、45.7%和52.8%。通過Western blotting對(duì)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明CHEQ-2可以激活MCF-7、HepG2和HT-29細(xì)胞中的Caspase-3及其下游底物PARP,使其活性形式增加。還可以增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)同時(shí)降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。 另外,在加入DCFH-DA熒光探針后,在CHEQ-2處理過的細(xì)胞中可以觀察到綠色熒光增多,熒光強(qiáng)度增強(qiáng),表明細(xì)胞中ROS水平升高。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,經(jīng)CHEQ-230μM處理48h后,MCF-7、HepG2及HT-29三種細(xì)胞中的ROS水平分別升高33.3%、359.8%及78.2%。在加入熒光探針JC-1后,可以觀察到陰性對(duì)照組的細(xì)胞呈紅色熒光,說明其線粒體膜電位較高。而經(jīng)CHEQ-230μM處理的三種細(xì)胞中分別有38.0%、72.7%及36.3%的細(xì)胞呈綠色熒光,表明這部分細(xì)胞的線粒體膜電位下降,線粒體功能受損。將CHEQ-2與抗氧化劑NAC合用,并對(duì)合用后細(xì)胞中的ROS水平、線粒體膜電位及細(xì)胞生存率進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NAC可以清除CHEQ-2刺激所產(chǎn)生的ROS,使之還原成正常水平,還可以消除CHEQ-2誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降。另外NAC還可以拮抗CHEQ-2的抗腫瘤活性,提高腫瘤細(xì)胞的生存率。在加入CHEQ-2之前用5mM的NAC預(yù)處理細(xì)胞,MCF-7、HepG2及HT-29的細(xì)胞生存率由37.3%、15.5%及44.7%,分別上升至57.3%、48.9%及63.2%。 急性毒性實(shí)驗(yàn)中,灌胃或腹腔給予小鼠2000mg/kg的CHEQ-2后,腹腔注射組有1只小鼠于給藥4h后死亡,繼續(xù)觀察14d未見小鼠再有死亡。而灌胃給藥組全部小鼠均無死亡現(xiàn)象。由此可見,腹腔給藥及灌胃給藥組LDso均高于2000mg/kg。同時(shí)對(duì)動(dòng)物的體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),灌胃給藥后對(duì)小鼠的體重沒有明顯影響,給藥組與空白對(duì)照組相比沒有顯著性差異。而腹腔給藥組在給藥1d后,會(huì)出現(xiàn)7.5%輕微的體重下降,第2天即開始逐漸恢復(fù)。 裸鼠實(shí)驗(yàn)表明,口服給予荷瘤小鼠CHEQ-210mg/kg每日1次,連續(xù)給藥2周,可明顯抑制HepG2腫瘤生長(zhǎng),抑制率可達(dá)43.0%,且對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。Western blotting檢測(cè)腫瘤組織蛋白顯示,CHEQ-2可以抑制腫瘤組織中CDC25A、CDC25B及Cyclin B的表達(dá),抑制率分別為51.3%、61.1%和64.1%。 結(jié)論： 以CHEQ-2為代表的吡啶并咪唑巰烷類化合物,具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性,通過抑制CDC25活性及表達(dá),調(diào)控CDK-Cyclin復(fù)合物,從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,遏制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。同時(shí),CHEQ-2可以促進(jìn)ROS生成,引起線粒體膜電位下降,經(jīng)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。另外,CHEQ-2在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了低毒、高效的特性,極具藥物開發(fā)潛力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Synthesis of tanshinoneⅡA analogues and their inhibitory activities against Cdc25 phosphatases[J];Chinese Chemical Letters;2009年12期

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本文編號(hào)：1486074