本文關(guān)鍵詞：紅緣擬層孔菌氯仿提取物對(duì)人結(jié)直腸癌SW-480細(xì)胞的增殖和遷移抑制及其作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 人結(jié)直腸癌SW-480細(xì)胞 紅緣擬層孔菌氯仿提取物(FPKc) 細(xì)胞凋亡 活性氧 遷移抑制

【摘要】：研究背景及目的紅緣擬層孔菌[Fomitopsis pinicola(Sw.:Fr.)P. Karst]為世界性分布的木腐真菌,因其具有一定藥用價(jià)值在西方國家以及中國、日本、韓國等亞洲國家均有廣泛應(yīng)用。例如,在西方國家,紅緣擬層孔菌主要用于治療頭暈、惡心和肝病等；而在中國,其主要用于祛風(fēng)除濕、解熱、強(qiáng)心、補(bǔ)肺益腎、和胃健脾、安神定志、扶正培本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,紅緣擬層孔菌對(duì)腦溢血、心臟病、糖尿病、貧血、腎炎、支氣管炎等病也有較好療效。近年來,紅緣擬層孔菌醇提物的抗腫瘤研究也屢見報(bào)道。因此,本論文以紅緣擬層孔菌中細(xì)胞毒性較強(qiáng)的氯仿提取物(FPKc)為主要研究對(duì)象,分析了其中的化學(xué)成分,評(píng)價(jià)了細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平的抗腫瘤效果,并對(duì)FPKc殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。旨在為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥研發(fā)提供理論依據(jù),同時(shí)為紅緣擬層孔菌應(yīng)用于結(jié)腸癌的臨床治療提供科學(xué)參考。研究方法及結(jié)果首先,建立高效液相色譜法,以茯苓酸,麥角甾醇和去氫齒孔酸標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照,定性定量分析紅緣擬層孔菌氯仿提取物(FPKc)的化學(xué)成分。結(jié)果顯示,麥角甾醇,茯苓酸和去氫齒孔酸在FPKc的含量分別為10.5%,3.56%和0.25%。此外,HPLC分析顯示,經(jīng)FPKc作用后的SW-480細(xì)胞裂解液中有麥角甾醇存在。其次,MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了FPKc對(duì)三種結(jié)直腸癌細(xì)胞的毒效應(yīng),結(jié)果表明,FPKc能不同程度抑制體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌SW-480、SW-620、Caco-2細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性；不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)FPKc的敏感程度也具有差異性,藥物作用48 h后,SW-480和SW-620細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50)分別為190.28 μg/ml和143.26 μg/ml,而藥物作用72 h后,FPKc對(duì)Caco-2細(xì)胞才表現(xiàn)出明顯的殺傷作用。FPKc殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制研究表明,其能夠誘導(dǎo)SW-480細(xì)胞發(fā)生凋亡,HO染色后,熒光顯微鏡下能夠觀察到明顯的核凝集現(xiàn)象；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：FPKc能夠?qū)W-480細(xì)胞的DNA造成明顯損傷,并引起細(xì)胞G1期阻滯；Western blotting結(jié)果顯示,FPKc能夠明顯活化Caspase-3和PARP,下調(diào)Bcl-2的表達(dá)；此外,FPKc能夠引起細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的下降,進(jìn)而引起胞內(nèi)活性氧的積累,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同步的研究結(jié)果也提示,FPKc中相對(duì)含量較高的ES同樣能夠誘導(dǎo)SW-480細(xì)胞發(fā)生凋亡。接下來,通過損傷修復(fù)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究了FPKc對(duì)SW-480細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果顯示,高濃度FPKc對(duì)SW-480細(xì)胞的遷移抑制率高達(dá)70%。借助免疫熒光法發(fā)現(xiàn)FPKc能夠顯著抑制SW-480細(xì)胞胞外基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)。同步的研究結(jié)果也提示,FPKc中相對(duì)含量較高的ES同樣能夠下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá),并抑制SW-480細(xì)胞的遷移。最后,利用腹腔注射和皮下接種構(gòu)建S180荷瘤小鼠模型,與對(duì)照組相比,FPKc能夠顯著抑制S180實(shí)體瘤體積,延長(zhǎng)腹水瘤小鼠的存活期,并明顯改善荷瘤小鼠的生存質(zhì)量。結(jié)論FPKc含有麥角甾醇,茯苓酸和去氫齒孔酸,其中麥角甾醇能夠被人結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞攝取,可能為FPKc發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分。體外實(shí)驗(yàn)證明,FPKc損傷細(xì)胞DNA,引起細(xì)胞周期阻滯于G1期,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且胞內(nèi)活性氧的過度積累可能是導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要誘因；FPKc還能夠通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá),抑制SW-480細(xì)胞的遷移；同步實(shí)驗(yàn)提示,麥角甾醇亦可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,其抗腫瘤作用機(jī)制與FPKc相似,由此佐證麥角甾醇可能是FPKc主要的抗腫瘤活性成分之一。在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明FPKc能夠顯著抑制S180荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活期。
【關(guān)鍵詞】：人結(jié)直腸癌SW-480細(xì)胞 紅緣擬層孔菌氯仿提取物(FPKc) 細(xì)胞凋亡 活性氧 遷移抑制
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R285
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 英文縮略詞表10-11
• 第1章 緒論11-17
• 1.1 中醫(yī)藥治療結(jié)直腸癌臨床研究現(xiàn)狀11-12
• 1.2 紅緣擬層孔菌的研究現(xiàn)狀12-17
• 1.2.1 化學(xué)成分13-14
• 1.2.2 生理活性14-17
• 第2章 論文的立論依據(jù)、內(nèi)容、目的和意義17-19
• 第3章 FPKc制備及色譜分析19-25
• 3.1 材料、試劑與及儀器19
• 3.1.1 材料與試劑19
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器19
• 3.2 方法19-21
• 3.2.1 FPKc的制備19-20
• 3.2.2 FPKc高效液相色譜分析20
• 3.2.3 SW-480細(xì)胞攝取FPKc成分測(cè)定20-21
• 3.3 結(jié)果與分析21-22
• 3.3.1 FPKc中三萜類化合物的定性定量分析21
• 3.3.2 SW-480細(xì)胞攝取FPKc中三萜類化合物的HPLC分析21-22
• 3.4 討論22-25
• 第4章 FPKc殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞及其作用機(jī)制研究25-47
• 4.1 材料、試劑與儀器25-28
• 4.1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng)25
• 4.1.2 試劑配制25-28
• 4.1.3 儀器設(shè)備28
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)分組28
• 4.2 方法28-32
• 4.2.1 細(xì)胞毒活性分析28-29
• 4.2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)29
• 4.2.3 細(xì)胞核形態(tài)觀察29
• 4.2.4 細(xì)胞DNA損傷效應(yīng)29-30
• 4.2.5 細(xì)胞周期阻滯分析30
• 4.2.6 Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白30-31
• 4.2.7 胞內(nèi)活性氧(ROS)含量分析31
• 4.2.8 胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平檢測(cè)31-32
• 4.2.9 ROS對(duì)FPKc殺傷SW-480細(xì)胞的作用分析32
• 4.2.10 數(shù)據(jù)分析32
• 4.3 結(jié)果與分析32-43
• 4.3.1 FPKc抑制結(jié)直腸癌SW-480、Caco-2、SW-620細(xì)胞的增殖32-33
• 4.3.2 FPKc誘導(dǎo)SW-480細(xì)胞凋亡33-34
• 4.3.3 FPKc對(duì)SW-480細(xì)胞核形態(tài)的影響34-35
• 4.3.4 FPKc引起SW-480細(xì)胞G1期阻滯35-36
• 4.3.5 FPKc損傷SW-480細(xì)胞DNA36-37
• 4.3.6 FPKc對(duì)SW-480細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的影響37-38
• 4.3.7 FPKc導(dǎo)致胞內(nèi)ROS水平過量積累38-39
• 4.3.8 FPKc下調(diào)胞內(nèi)GSH水平39-40
• 4.3.9 抑制ROS生成顯著降低FPK的抗腫瘤作用40-43
• 4.4 討論43-47
• 第5章 FPKc對(duì)SW-480細(xì)胞的遷移抑制作用47-51
• 5.1 材料、試劑與儀器47
• 5.2 方法47-48
• 5.2.1 創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)47
• 5.2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)47-48
• 5.2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)含量分析48
• 5.3 結(jié)果與分析48-50
• 5.3.1 FPKc抑制SW-480細(xì)胞的遷移48-49
• 5.3.2 FPKc下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)49-50
• 5.4 討論50-51
• 第6章 FPKc體內(nèi)抗腫瘤活性研究51-55
• 6.1 材料、試劑與儀器51
• 6.2 方法51-52
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)分組51
• 6.2.2 處理方法51-52
• 6.3 結(jié)果與分析52-53
• 6.3.1 FPKc改善荷瘤小鼠生理狀態(tài)52
• 6.3.2 FPKc抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活期52
• 6.3.3 FPKc初步安全性評(píng)價(jià)52-53
• 6.4 討論53-55
• 第7章 結(jié)論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 致謝65-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果67

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張麗萍，，苗春艷，張秉信;紅緣層孔菌多糖FP_2的結(jié)構(gòu)與體外抗腫瘤作用的研究[J];東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1994年02期

2 楊惠英;;結(jié)直腸癌病理診斷及誤診原因分析[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2010年14期

3 陳先暉;閆浩;戈群妹;尹婷;周敏;蔣繼宏;;紅緣擬層孔菌醇提物弱極性成分分析及抗腫瘤、抗氧化活性[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年01期

本文編號(hào)：1085641