【摘要】 研究背景：深靜脈血栓形成是骨科臨床常見并發(fā)癥之一，好發(fā)于下肢骨折患者，如血栓脫落可引起致命性肺栓塞，晚期常遺留靜脈炎綜合征，嚴重影響患者的康復及生命安全。新近有研究表明富亮氨酸重復序列相互作用蛋白1（LRRFIP1）可能與血栓的形成有重要聯(lián)系。LRRFIP1基因及其編碼的蛋白質(zhì)，通過與血小板細胞膜上表達的相關(guān)蛋白相互作用，血小板細胞骨架的結(jié)構(gòu)進而發(fā)生改變，影響血小板的凝血功能并導致血栓的形成。因此我們擬通過RNA干擾技術(shù)靶向沉默LRRFIP1基因，并建立動物模型，觀察LRRFIP1基因?qū)ι铎o脈血栓形成的影響，探討LRRFIP1基因沉默對預防骨科深靜脈血栓形成的效果，為最終應用于在體基因治療深靜脈血栓提供相關(guān)實驗依據(jù)。研究方法：1、LRRFIP1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建設計并合成LRRFIP1基因靶向的雙鏈DNA：根據(jù)GenBank報道的小鼠LRRFIP1基因序列，通過將Ambion公司的設計軟件與RNA干擾序列的設計原則相結(jié)合，設計出3對針對LRRFIP1基因shRNA的寡核苷酸序列，分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞，RT-PCR和western blot測定沉默效率，使用沉默效率最高的質(zhì)粒構(gòu)建LRRFIP1基因RNAi的慢病毒載體。2、小鼠骨髓細胞原代分離與培養(yǎng)將1周齡的新生小鼠消毒后處死，分離骨髓細胞，接種于無菌培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取生長良好的第三代細胞進行后續(xù)實驗。3、小鼠骨髓細胞慢病毒感染在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，將3⁵X104個目的細胞接種至每個孔內(nèi)，50%左右細胞的貼壁率應在鋪板時達到，每孔培養(yǎng)基體積為100μl；70%左右的細胞貼壁率應在進行病毒感染時達到。感染96小時后，在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光，估計慢病毒感染目的細胞的效率。4、動物分組與給藥將健康成年雄性ICR小鼠（20±2g）隨機分為：1)正常對照組（control）；2)假手術(shù)組（sham）：不給藥；3)低分子肝素（LMWH）治療組（LMWH）：術(shù)前通過尾靜脈注射LMWH一次(2000U·kg^-1)，術(shù)后每日注射一次LMWH (2000U·kg^-1·d^-1)；4)模型組（model）：術(shù)前、術(shù)后每日注射等體積生理鹽水；5) LRRFIP1shRNA治療組（shRNA）：術(shù)前注射LRRFIP1shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs （1×10⁷cells/mouse）；6)陰性shRNA治療組（Negative shRNA）：術(shù)前注射LRRFIP1陰性對照shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs （1×10⁷cells/mouse）；采用下腔靜脈結(jié)扎法制作小鼠深靜脈模型。分別于術(shù)后第1、3、7天每組處死6只小鼠。稱量血栓重量；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清p選擇素及D二聚體水平，Western blot檢測血栓中LRRFIP1蛋白的表達。5、統(tǒng)計分析計量資料表示為means±S.D。采用SPSS17.0for Windows進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Fisher LSD分析。以p<0.05作為有統(tǒng)計學差異。結(jié)果：1.成功構(gòu)建了攜LRRFIP1shRNA的慢病毒載體，LRRFIP1shRNA轉(zhuǎn)染后LRRFIP1基因及蛋白表達均顯著降低；2. LRRFIP1shRNA顯著抑制血栓中LRRFIP1蛋白表達。在模型組中，在術(shù)后第1、3、7天血栓中LRRFIP1蛋白的表達顯著降低（P<0.01）。在所觀察的3個時間點上，使用LRRFIP1shRNA處理可以進一步抑制LRRFIP1在血栓中的表達，提示LRRFIP1shRNA慢病毒在體內(nèi)可以有效抑制LRRFIP1的表達。但低分子肝素和陰性shRNA對LRRFIP1表達無影響。3. LRRFIP1shRNA顯著抑制小鼠下肢靜脈血栓形成。LRRFIP1shRNA抑制體內(nèi)血栓形成明顯的。在術(shù)后第7天，模型組小鼠血栓重量為8.63±0.40mg，在LRRFIP1shRNA治療組，血栓重量降低到2.15±0.57mg （P<0.01）。血栓形成抑制率為75.10%。而在低分子肝素治療組和陰性shRNA治療組，血栓重量分別為2.20±0.33mg和6.47±0.66mg，血栓形成抑制率分別為74.50%and25.02%。4. LRRFIP1shRNA能夠降低小鼠血清p-選擇素和d-二聚體水平。與正常對照組和假手術(shù)組相比，模型組血漿P-選擇素水平明顯增加（P<0.01）。LRRFIP1shRNA治療顯著降低血漿P-選擇素水平（P<0.01）。血漿D-二聚體水平在模型組也明顯升高（P<0.01），而LRRFIP1shRNA治療可顯著地抑制D-二聚體水平的上調(diào)（P<0.01）。然而，低分子肝素和陰性shRNA對血漿P-選擇素、D-二聚體水平的影響不大。結(jié)論：1.成功構(gòu)建了LRRFIP1shRNA表達質(zhì)粒及慢病毒載體；2. LRRFIP1shRNA在體內(nèi)、外均能夠抑制LRRFIP1mRNA和蛋白表達；3. LRRFIP1基因干擾能抑制小鼠下肢深靜脈血栓形成；4. LRRFIP1shRNA抑制深靜脈血栓形成與其降低血漿p-選擇素和d-二聚體水平有關(guān)。 

第一章   前     言  

深靜脈血栓(DVT)形成是骨科臨床常見并發(fā)癥之一，好發(fā)于下肢骨折患者。血栓好發(fā)于下肢深靜脈，以髂靜脈、股靜脈多見。如血栓脫落可引起致命性肺栓塞，晚期常遺留靜脈炎綜合征，包括遺留腫脹、淤積性皮炎、遷延不愈的小腿潰瘍等等，病情嚴重者具有截肢的可能，嚴重影響患者的康復及生命安全。但骨科臨床在對深靜脈血栓形成經(jīng)過正規(guī)預防后：如物理預防及藥物預防措施后仍有約 20%的下肢骨折與大關(guān)節(jié)置換患者存在 DVT，具體的發(fā)病機制仍不清楚。 

新近有研究表明富亮氨酸重復序列相互作用蛋白 1(LRRFIP1)可能與血栓的形成有重要聯(lián)系。研究者通過一項對 500 名受試者的研究分析發(fā)現(xiàn)，LRRFIP1 基因及其編碼的蛋白質(zhì)，通過與血小板細胞膜上表達的相關(guān)蛋白相互作用，血小板細胞骨架的結(jié)構(gòu)進而發(fā)生改變，從而影響血小板的凝血功能并導致血栓的形成。因此我們通過 RNA干擾技術(shù)靶向沉默 Lrrfip1 基因，并建立動物模型，觀察 Lrrfip1 基因?qū)ι铎o脈血栓形成的影響，探討 Lrrfip1 基因沉默對預防骨科深靜脈血栓形成的效果，為最終應用于在體基因治療深靜脈血栓提供相關(guān)實驗依據(jù)。 

近年來，隨著社會的快速進步與發(fā)展，骨創(chuàng)傷患者越來越多，以及隨著骨科大手術(shù)的廣泛開展，如：人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(total hip replacement，THR)、人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(total knee replacement，TKR)和髖部周圍骨折手術(shù)(hip fractures surgery，HFS)，靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)的報道也日益增多。靜脈血栓栓塞癥包 括 深 靜 脈 血 栓 形 成 (deep  vein  thrombosis ， DVT) 和 肺 栓 塞 (pulmonary thromboembolism，PTE)，這是 VTE 在肢體不同部位和不同階段的兩種臨床表現(xiàn)形式。骨科臨床中 DVT 發(fā)生率較高，是臨床上引起并發(fā)癥和死亡的一個重要原因。國外研究表明，在 THR 病人中 DVT 的發(fā)生率為 42~57%，PTE 的發(fā)生率為 0.9~28%，致死性 PTE 的發(fā)生率為 0.1~2%；在 TKR 病人中 DVT 的發(fā)生率為 41~85%，PTE 的發(fā)生率為 1.5~10%，致命性 PTE 的發(fā)生率為 0.1~1.7%；在 HFS 病人中 DVT 的發(fā)生率為46~60%，PTE 的發(fā)生率為 3~11%，致命性 PTE 的發(fā)生率為 0.3~7.5%；一項亞洲國家多中心的研究結(jié)果顯示：骨科大手術(shù)后深靜脈血栓形成發(fā)生率為 43.2%。國內(nèi)相關(guān)臨床研究報告骨科大手術(shù)后深靜脈血栓形成發(fā)生率為 20.6~47.1%。 

1884 年，Virchow 等人提出引起血栓形成的三個條件：血管內(nèi)皮細胞的損傷，血流狀態(tài)的改變，血液凝固性的增加。其中血小板的激活在血栓形成過程中起著非常重要的作用。血小板產(chǎn)生于來自于骨髓中的成熟的巨核細胞，巨核細胞成熟后，它的細胞膜表面會有血多凹陷形成，互相臨近的凹陷的細胞膜在凹陷部位的深部相互發(fā)生融合，緊接著巨核細胞的一部分胞質(zhì)會與巨核細胞母體分離開來，最終這些成分將從巨核細胞上脫離，通過血竇進入機體血液循環(huán)成為血小板。血小板的主要功能是促進止血和加速凝血，同時維護毛細血管壁的完整性是其另外一個重要的功能，當血管破損時，損傷部位激活因素刺激血小板，使得血小板聚集在血管破損部位，成為富含血小板的凝塊，接著血小板又會形成凝血酶，這些凝血酶將會刺激周圍血漿組織中的纖維蛋白原，促使其演變?yōu)槔w維蛋白，這些相互交織的纖維蛋白會包裹血小板凝塊，繼而這些血小板凝塊與血細胞纏結(jié)在一起最終成為血凝塊，即形成血栓。另一方面血小板表面的突起會伸出進入纖維蛋白網(wǎng)內(nèi)，血小板肌動蛋白和收縮后的肌球蛋白會使已經(jīng)形成的血凝塊收縮，形成更為堅實的血栓，更有效地起到止血作用。血小板被激活后還能釋放血栓素 A2、致密顆粒和 α 顆粒、ADP、5-羥色胺、血小板第 4 因子、β 血栓球蛋白、凝血酶敏感蛋白、細胞生長因子、血液凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅻ和血管通透因子等等，以上這些活性物質(zhì)會通過激活相鄰的血小板、促血管收縮、促纖維蛋白形成等多種形式加強止血效果。有學者認為，凝血因子 V 的變異可能與 DVT 的發(fā)生有關(guān)。凝血因子 V 是一種糖蛋白，在機體凝血過程中處于內(nèi)外源性凝血途徑的交叉點，凝血因子V能夠加速和促進凝血酶原的激活和生成凝血酶，若凝血因子V發(fā)生基因突變后，則稱為因子 V Leiden，靜脈血栓形成的常見危險因素就是凝血因子 V 發(fā)生基因突變。有研究通過對國外 2063 位手術(shù)或創(chuàng)傷后深靜脈血栓形成的患者進行檢測凝血因子 V后發(fā)現(xiàn)，30%的病人發(fā)生變異而成為因子 V Leiden。

第二章  LRRFIP1 基因 RNA 干擾慢病毒載體的構(gòu)建及 轉(zhuǎn)染效率的鑒定  

2.1 實驗材料 

2.1.1  菌株與質(zhì)粒 

2.1.1.1  實驗菌株   

◆ Escherichia coli DH5α 

2.1.1.2  表達質(zhì)粒  GFP 蛋白表達載體 pGCL-GFP 

2.1.2  主要酶類與分子量標準 

◆ Taq DNA polymerase(TaKaRa) 

◆ Pfu DNA polymerase(TaKaRa) 

◆ T4 DNA Ligase(Roche) 

◆  限制性內(nèi)切酶 Hpa I、Xho I(TaKaRa) 

◆ 1kb DNA Ladder(MBI Fermentas) 

◆ DNA Ladder，Mix(MBI Fermentas) 

◆ 100bp O’ Gene Ruler(MBI Fermentas) 

◆ DL2000 DNA Marker(TaKaRa) 

◆  蛋白質(zhì)中范圍分子量預染 Marker(Thermo Scientific) 

◆  蛋白質(zhì)寬范圍分子量預染 Marker(Thermo Scientific) 

2.1.3  主要抗體與試劑盒 

◆  兔抗鼠 LRRFIP1 多克隆抗體(Sigma-Aldrich) 

◆ HRP 標記山羊抗兔 IgG 抗體(上海聯(lián)科生物公司) 

◆  小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒(QIGEN) 

◆  大量質(zhì)粒抽提純化試劑盒(QIGEN) 

◆  小量膠回收試劑盒(QIGEN) 

◆ PCR 試劑盒(Toyobo) 

2.1.4  試驗所需主要試劑及配制方法 

2.1.4.1  培養(yǎng)基及其所需試劑 

◆ LB 液體培養(yǎng)基：準確稱重 10g 胰化蛋白胨(tryptone, Oxoid)，5g 酵母提取物(yeast extract, Oxoid)，950ml ddH2O 中加入 10g 氯化鈉，充分搖動使之完全、充分溶解，使用 1mol/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液 pH 值至 7.0，定容至 1000ml，在 1.034×105Pa 高壓蒸汽滅菌備用，滅菌時間為 20min(使用前通過加入 100mg/ml 氨芐青霉素調(diào)節(jié)終濃度為100μg/ml)。 

◆ 2% LB 固體培養(yǎng)基：準確稱取 2g 的瓊脂粉加入至 100ml LB 液體培養(yǎng)基中，高壓蒸汽滅菌消毒，滅菌時間為 20min。自高壓滅菌器中取出滅菌后的培養(yǎng)基，輕輕旋動培養(yǎng)基，使瓊脂均勻地溶解至整個培養(yǎng)基溶液中，靜置后使得培養(yǎng)基的溫度降至50℃左右后，通過加入 100mg/ml 氨芐青霉素至固體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)其終濃度為100μg/ml，然后從保存燒瓶中直接傾倒出培養(yǎng)基，進而鋪制平板。 

◆ 100mg/ml 氨芐青霉素溶液：5ml ddH2O 中加入氨芐青霉素 500mg，使用 0.22μm孔徑濾膜過濾，達到除菌目的，然后進行分裝置于-20℃條件保存。 2.1.4.2  瓊脂糖凝膠電泳所用試劑 

◆ 50×TAE 電泳緩沖液：準確稱重 Tris 堿 242 g，冰乙酸 57.1 ml，所需 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)  100  ml，加入 ddH2O 將其定容至 1000  ml，保存條件為避光，使用時需按 1∶50 濃度進行稀釋。 

2.2 實驗方法 

2.2.1 LRRFIP1 基因 RNAi 慢病毒載體的構(gòu)建： 

2.2.1.1 設計并合成 LRRFIP1 基因靶向的雙鏈 DNA：根據(jù) GenBank 報道的小鼠LRRFIP1 基因序列，通過采用 Ambion 公司的設計軟件與 RNA 干擾序列的設計原則相結(jié)合，設計出 3 對針對 LRRFIP1 基因 shRNA 的寡核苷酸序列，分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 293T 細胞； 

2.2.1.1.1 LRRFIP1 shRNA 表達質(zhì)粒的構(gòu)建  Hpa I 和 Xho I 酶切 pGCL-GFP 載體以使其線性化； 酶切產(chǎn)物的回收，使用小量膠回收試劑盒，將 pGCL-GFP 載體酶切產(chǎn)物回收純化，具體操作方法如下： 

(1)水平電泳后，割下約 200mg 左右的包含目的條帶的低熔點瓊脂糖塊，置于 1.5ml離心管中。 

(2)加入 600 微升  S1 液，置于 55℃水浴中 10 分鐘，每 2 分鐘顛倒混勻一次，完全溶化瓊脂糖塊。 

(3)將完全溶化后的凝膠溶液移至入吸附柱內(nèi)，12000rpm 離心，離心時間為 1 分鐘，將收集管里面的液體倒掉，再將吸附柱放入同一個收集管中。 

(4)將 500?l W1 液(已加無水乙醇)加入吸附柱中，12000rpm 離心，離心時間為 15秒，然后將收集管中的液體倒掉，將吸附柱置入同一個收集管中。 

(5)在吸附柱中加入 500?l W1 液(已加無水乙醇)，靜置 1 分鐘后，12000rpm，離心15s。將收集管里面的液體倒掉，再將吸附柱放入同一個收集管中。 

(6)12000rpm，離心時間為 1 分鐘。 

(7)將吸附柱放入一個干凈的 1.5ml 的離心管中，將 30?l 的 T1 液加入吸附膜中央，靜置 1 分鐘后，12000rpm 離心，離心時間 1 分鐘，洗脫液-20℃條件下進行貯存。 

目的片段與載體的連接，經(jīng)退火形成的雙鏈 DNA，在與雙酶切后的 pGCL-GFP載體相互連接結(jié)合，連接反應體系：其中包括酶切回收的載體脫氧核糖核酸(100 ng/μL)1μL，退火的雙鏈脫氧核糖核酸(100 ng/μL)1μL, 10×T4 噬菌體脫氧核糖核酸連接酶緩沖液 1μL，T4 噬菌體脫氧核糖核酸連接酶 1μL, ddH2O 6μL，于 4℃條件下 12 小時連接反應制備克隆連接液，準備轉(zhuǎn)化；  37℃條件下振搖 16 小時轉(zhuǎn)化到 DH5α。 

第三章  小鼠骨髓細胞慢病毒感染及深靜脈血栓動物模型的建立.........27 

3.1 試驗材料 ................27 

3.2 試驗方法 ............27 

3.3 試驗結(jié)果 ..............29 

3.4 小     結(jié) ..................34 

3.5 討     論 ................34 

第四章  LRRFIP1 基因干擾對小鼠深靜脈血栓形成的作用...................37 

4.1 實驗材料 ............37 

4.2 實驗方法 ...................37 

4.3  實驗結(jié)果 ..................42

4.4 小     結(jié) ................45 

4.5 討     論 ....................45 

全文總結(jié).................50 

第四章  LRRFIP1 基因干擾對小鼠深靜脈血栓形成的作用  

4.1 實驗材料 

4.1.1  實驗動物 

1 周齡的小鼠 134 只(由第三軍醫(yī)大學動物中心提供)。 

4.1.2  實驗器材 ? 高速冷凍離心機  

細胞培養(yǎng)箱(艾普瑞) 

超凈工作臺(蘇州三興凈化) 

普通顯微鏡(尼康) 

37℃水浴鍋 ? 熒光倒置顯微鏡(尼康)。 

4.1.3  主要試劑 

PBS 溶液(粉末，溶液配制好后需要在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌)

DMEM/F12 培養(yǎng)基(購至 GIBCO) 

胎牛血清(購至 Hyclone) 

雙抗(青霉素、鏈霉素) 

胰酶(北京賽馳生物，使用時濃度為 0.25%，含 0.02%EDTA，制備時即取 250mg胰酶和 20mgEDTA 溶于 100mLPBS 溶液，并在無菌操作臺上用一次性過濾器過濾)

BIZOL 保存液(碧云天) 

紅細胞裂解液(碧云天) 

慢病毒 GPH-Lrrfip-sh1(滴度 1×109TU/ml，100 μl) 

慢病毒陰性對照(滴度 2×109 TU/ml，250 μl) 

4.2 實驗方法 

.2.1  小鼠骨髓細胞原代分離與培養(yǎng) 

4.2.1.1  將 1 周齡的新生小鼠 8 只裝在 250mL 燒杯中帶入細胞培養(yǎng)室內(nèi)，先用酒精棉球擦洗乳鼠，用大鑷子夾其頸部致死，然后把整個動物浸入盛有 75%乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出用大頭針固定在泡沫板上。先用碘酒擦洗胸腹部，再用酒精擦洗，用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出小鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉，PBS 溶液沖洗兩遍。8 只乳鼠均按以上操作。 

4.2.1.2  用無菌消毒的剪刀從中折斷骨頭，用 1ml 無菌注射器吸取 PBS 溶液沖洗骨髓細胞多次，再用針頭吹打，最后用吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min 離心 5min，棄上清。 

全文總結(jié)  

1.  成功構(gòu)建的 LRRFIP1 shRNA 在體外能夠抑制 LRRFIP1 mRNA 和蛋白表達； 

2. LRRFIP1 shRNA 慢病毒在體內(nèi)能抑制 LRRFIP1 蛋白表達； 

3. LRRFIP1 基因干擾能抑制小鼠下肢深靜脈血栓形成；

4.  LRRFIP1  shRNA 抑制深靜脈血栓形成與其降低血漿 p-選擇素和 d-二聚體水平有關(guān)。  
 

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