本文關(guān)鍵詞：甲拌磷急性中毒相關(guān)基因在大鼠臟器的表達研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:應(yīng)用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測大鼠臟器中(心、肝、肺、腦和腸)甲拌磷中毒相關(guān)基因(ACh E、BCh E、PON-1和FOS)m RNA的表達,篩選出表達變化有統(tǒng)計學(xué)意義的臟器和中毒相關(guān)基因;檢測中毒相關(guān)基因在中毒致死大鼠臟器中的m RNA表達量,探討甲拌磷中毒相關(guān)基因m RNA表達變化在中毒死亡時間推斷的可行性,在法醫(yī)學(xué)中為甲拌磷中毒死亡時間的推斷提供科學(xué)的依據(jù)。方法:健康成年雌性SD大鼠24只,隨機分為空白對照組、急性中毒死亡組、中毒死亡1d組和中毒死亡7d組。急性中毒死亡組、中毒死亡1d組和中毒死亡7d組分別用3LD50的甲拌磷對大鼠進行灌胃,死亡后分別立即解剖取心、肝、肺、腦和腸,放置1d后解剖取肝臟和放置7d后解剖取肝臟�？瞻讓φ战M用同樣體積的生理鹽水對大鼠進行灌胃,乙醚麻醉后立即解剖取心、肝、肺、腦和腸,實驗組和空白對照組所取樣本重量均約為30mg,取材后立即置于液氮中保存待檢。各樣本用TRIzol總RNA提取試劑TRIzol Reagent提取總RNA,1%非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測總RNA純度、濃度及其完整性,以β-actin作為內(nèi)參基因,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,梯度濃度稀釋c DNA原液,分別建立ACh E、BCh E、PON-1、FOS和β-actin的相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線;SYBR Green I嵌合熒光法實時定量PCR技術(shù)檢測各目的基因m RNA相對表達量,進行統(tǒng)計學(xué)分析,研究其在中毒致死大鼠臟器表達量的變化。結(jié)果:提取的總RNA經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測純度、濃度及其完整性較好,均可滿足后續(xù)實驗要求。內(nèi)參基因β-actin與目的基因ACh E、BCh E、PON-1和FOS的擴增效率分別為109.2%、100.9%、108.7%、105.3%和100.91%,一致性較好,說明內(nèi)參基因選擇正確;擴增曲線為光滑的S型曲線,基線較平,拐點清楚,平臺期平行性較好,說明反應(yīng)過程良好,沒有非特異性產(chǎn)物出現(xiàn),引物設(shè)計良好且特異性強;β-actin基因熔解溫度為85°C,ACh E、BCh E、PON-1和FOS基因熔解溫度分別為87.5°C、82.5℃、81.5℃和89℃,熔解曲線是單一的較高的尖峰,底部平而窄,無雜峰出現(xiàn),說明這些基因擴增的特異性較強,沒有引物二聚體的出現(xiàn)。急性中毒死亡組目的基因ACh E、BCh E、PON-1和FOSm RNA在大鼠心臟中表達分別為空白對照組的8.79倍(P0.05)、1.86倍(P0.05)、45.64%(P0.05)和1.15倍(P0.05);肝臟中分別為空白對照組的8.59倍(P0.05)、1.89倍(P0.05)、1.09倍(P0.05)和3.60倍(P0.05);肺中分別為空白對照組的5.44%(P0.05)、67.00%(P0.05)、1.11倍(P0.05)和3.99倍(P0.05);腦中分別為空白對照組的10.69%(P0.05)、92.54%(P0.05)、2.12倍(P0.05)和13.91%(P0.05);腸中分別為空白對照組的8.01%(P0.05)、1.08倍(P0.05)、0.84%(P0.05)和49.86%(P0.05)。中毒死亡1d組目的基因ACh E、BCh E、PON-1和FOSm RNA在大鼠肝臟中表達分別為空白對照組的53.92倍(P0.05)、33.64%(P0.05)、46.25%(P0.05)和1.33倍(P0.05);中毒死亡1d組各目的基因m RNA在大鼠肝臟中表達分別為急性中毒死亡組的6.27倍(P0.05)、17.80%(P0.05)、42.43%(P0.05)和37.02%(P0.05)。中毒死亡7d組肝臟中提取的總RNA經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)已無明顯的條帶(18S和28S),逆轉(zhuǎn)錄經(jīng)RT-PCR擴增后也無明顯的S型擴增曲線,說明7d后各基因的總RNA已降解,可認(rèn)為其表達量為0。結(jié)論:除了PON-1基因以外,肝臟中ACh E、BCh E和FOS基因m RNA的表達均有統(tǒng)計學(xué)意義,可以作為甲拌磷急性中毒相關(guān)基因表達研究的靶器官;BCh E基因在心臟和肝臟中表達穩(wěn)定且有統(tǒng)計學(xué)意義,可以作為甲拌磷急性中毒的基因表達標(biāo)志;急性中毒死亡組、中毒死亡1d組在肝臟中BCh E基因m RNA的表達分別為空白對照組的1.89倍(P0.05),33.64%(P0.05),表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢,與急性甲拌磷農(nóng)藥中毒死后放置時間存在一定的關(guān)系,其時序性變化可望作為急性甲拌磷中毒死亡時間推斷的指標(biāo)之一,但是由于時間點太少,有待于探索7d內(nèi)該基因m RNA具體變化趨勢;實時熒光定量PCR技術(shù)對于分子水平的改變的檢測具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性,適合法醫(yī)學(xué)實驗研究和案件偵破的需求。
【關(guān)鍵詞】：急性甲拌磷中毒 中毒相關(guān)基因 實時熒光定量PCR 死亡時間
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：D919
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 第一部分 甲拌磷急性中毒致死大鼠臟器中中毒相關(guān)基因的表達研究13-40
• 1 材料與方法13-19
• 2 結(jié)果19-40
• 第二部分 中毒相關(guān)基因隨死亡時間在大鼠肝臟中的表達研究40-54
• 1 材料與方法40-42
• 2 結(jié)果42-54
• 討論54-59
• 小結(jié)59-61
• 參考文獻61-64
• 綜述64-70
• 參考文獻68-70
• 致謝70-71
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果71-72
• 個人簡歷72

【參考文獻】

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1 喻洪江;，

本文編號：395014