本文關(guān)鍵詞：對骨骼、牙齒DNA提取方法的深入研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本課題旨在對法醫(yī)檢案中骨骼和牙齒這兩種特殊檢材進行DNA檢測,通過對不同脫鈣劑、消化液的深入研究,采用SPSS軟件分析比較不同提取方法的骨骼DNA濃度值,尋找最合適的脫鈣劑和消化液,建立一套程序相對簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、清晰可靠,DNA提取效率高的提取方法。方法:1用不同的酸類脫鈣液(自制10%鹽酸脫鈣液、10%硝酸脫鈣液、硝酸和甲酸混合脫鈣液、甲酸脫鈣液、HAS改良脫鈣液)對骨粉采用常規(guī)方法(脫鈣,消化、純化、擴增、3130XL遺傳分析儀等的一系列過程)進行DNA分型圖譜分析;2用不同濃度的EDTA脫鈣液(0.25mol/L、0.5mol/L、1mol/L)對骨粉進行脫鈣,每組脫鈣時間嚴(yán)格按編號從小到大采用3h、6h、12h、24h分別進行。各組脫鈣完畢后均采用同種方法消化、純化、DNA濃度測定、擴增、3130XL遺傳分析儀進行DNA分型圖譜分析,尋求最合適的EDTA脫鈣液濃度和作用時間;3用三種不同種類的消化液(CTAB、Bone incubation buffer、QIAamp DNA Investigator)對骨粉進行消化,純化、DNA濃度測定及SPSS軟件統(tǒng)計分析、擴增、3130XL遺傳分析儀進行DNA圖譜分析,找到最合適的消化液;4用三種不同的消化液(CTAB、Bone incubation buffer、QIAamp DNA Investigator)對牙齒消化,純化、擴增、3130XL遺傳分析儀進行DNA圖譜分析,目的是為了證明同樣的硬組織采用上述方法進行提取,同時對上述方法予以驗證。結(jié)果:1通過嚴(yán)格配制的酸性溶液雖然對組織及細胞均有很強的脫鈣作用,但是也對DNA具有很強破壞作用,因此得到的DNA量也相對很少甚至破壞徹底,根本得不到完整的DNA分型。2在3h-24h時間段內(nèi),骨骼DNA經(jīng)三種不同濃度的EDTA脫鈣液脫鈣后濃度值呈現(xiàn)的趨勢不同,0.25mol/L實驗組呈大致增高趨勢,且在12-24h濃度均值達到頂峰,16個STR基因座全部檢出率為62.5%;0.5mol/L實驗組呈先升高再降低的趨勢,在6-12h濃度均值最高,16個STR基因座全部檢出率為90%;1mol/L實驗組呈降低趨勢,在3-6h濃度均值最高,16個STR基因座全部檢出率為67.5%。而當(dāng)比較脫鈣時間一致而EDTA脫鈣液濃度不同時,0.5mol/L實驗組在不同的時間段上所得到的DNA濃度值仍然均高于其他兩組。3一克骨粉經(jīng)不同消化方法(Bone incubation buffer法、DNA Investigator Kit法和CTAB法)得到的DNA量分別為26.53±5.47ng/μL、23.63±4.56ng/μL、14.93±3.88ng/μL,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)中單因素方差分析表明三組數(shù)據(jù)之間的差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時PCR擴增后電泳檢測結(jié)果顯示Bone incubation buffer法和DNA Investigator Kit法基因座檢出率和RFU值大致相同,均優(yōu)于CTAB法。4采用與骨骼一致的CTAB、Bone incubation buffer、DNA Investigator kit三種提取方法對牙齒進行DNA檢驗,同樣印證了上述實驗方法得到結(jié)果的準(zhǔn)確性,即CTAB法得到的DNA量較少,峰值較低,個別分型有缺如位點,與其他兩種方法差異明顯。結(jié)論:1在醫(yī)學(xué)實驗中常用鹽酸、硝酸、甲酸、水楊酸、乙酸等酸脫鈣劑對骨組織脫鈣后進行病理涂片等效果明顯,但用其對骨骼樣本脫鈣后進行PCR復(fù)合擴增,未得到理想分型結(jié)果,表明此類脫鈣劑目前已不適合法醫(yī)物證領(lǐng)域骨骼、牙齒DNA的提取。2在3-24小時時間段內(nèi),骨骼樣本經(jīng)三種不同濃度的EDTA脫鈣液脫鈣后DNA濃度值形成不同的趨勢,0.25mol/L EDTA脫鈣液組呈現(xiàn)出上升趨勢,0.5mol/L EDTA脫鈣液組呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢,1mol/L EDTA脫鈣液組呈現(xiàn)出下降趨勢,其中0.5mol/L EDTA脫鈣液作用6-12小時DNA濃度值可形成最高峰,說明選擇濃度適中的脫鈣液至關(guān)重要,濃度太低或太高都對DNA的提取不利,因此在檢案中把脫鈣時間控制在6-12小時之間為最佳。3采用CTAB、Bone incubation buffer、DNA Investigator kit三種提取方法得到的骨骼DNA濃度經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計分析,結(jié)果表明三種方法之間的差異性存在統(tǒng)計學(xué)意義,CTAB法得到的DNA量較少,與其他兩種方法差異甚是明顯,其他兩組盡管在統(tǒng)計學(xué)意義上存在差異,但DNA擴增出來的效果差別并不大。4在法醫(yī)實際檢案過程中,對于硬組織骨骼、牙齒DNA的提取均可把Bone incubation buffer法和DNA Investigator Kit法作為優(yōu)選方案,經(jīng)實驗驗證兩種試劑盒得到的DNA分型圖譜及峰值差別不是很明顯,得到的STR分型均完整性較高。
【關(guān)鍵詞】：法醫(yī)物證學(xué) 骨骼 牙齒 DNA提取方法 比較
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：D919.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 不同脫鈣液對骨骼DNA提取效率的影響14-22
• 1 材料14-16
• 2 方法16-18
• 3 結(jié)果18-20
• 4 討論20-21
• 5 小結(jié)21-22
• 第二部分EDTA脫鈣液濃度和時間對骨骼DNA提取效率的影響22-30
• 1 材料22-23
• 2 方法23-25
• 3 結(jié)果25-28
• 4 討論28-29
• 5 小結(jié)29-30
• 第三部分 不同消化液對骨骼DNA提取效率的影響30-40
• 1 材料30-31
• 2 方法31-32
• 3 結(jié)果32-38
• 4 討論38
• 5 小結(jié)38-40
• 第四部分 不同消化液對牙齒DNA提取效率的影響40-46
• 1 材料40
• 2 方法40-42
• 3 結(jié)果42-44
• 4 討論44-45
• 5 小結(jié)45-46
• 第五部分46-49
• 真實案例分析（一）46-47
• 真實案例分析（二）47-49
• 參考文獻49-51
• 綜述51-59
• 參考文獻57-59
• 致謝59-60
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果60-61
• 個人簡歷61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 葉健;季安全;鄭秀芬;姜成濤;趙鑫;張純斌;胡蘭;;陳舊性骨骼DNA提取技術(shù)的研究[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2001年S1期

2 王靜,劉雅誠,馬萬山,霍振義,嚴(yán)江偉,唐暉;骨骼DNA分析的應(yīng)用研究[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

3 陳愛萍;劉峰;尹路;;使用PrepFiler試劑盒提取牙齒檢材DNA[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2012年01期

  本文關(guān)鍵詞：對骨骼、牙齒DNA提取方法的深入研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：315692