【摘要】： 目的：應(yīng)用免疫組化SABC法、免疫印跡Western Bloting法和實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測大鼠腦挫傷后HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的時序性表達規(guī)律,探討HIF-1α推斷腦挫傷的可行性,旨在為法醫(yī)實踐中推斷腦挫傷經(jīng)過時間提供依據(jù)。 方法：選取健康成年SD大鼠64只,隨機分為對照組和實驗組,每組8只。參照Feeney法建立大鼠閉合性腦挫傷模型,實驗組按損傷時間不同分為傷后1h、6h、12h、48h、72h、7d、14d共7組,對照組動物僅切開頭皮,有頂開骨窗,不致腦損傷,在損傷后依規(guī)定時間內(nèi)處死動物,對照組動物于鉆孔后1h處死,取出腦組織,以腦挫傷灶為中心旁開1mm行大鼠腦冠狀切面取材,置于4%多聚甲醛PBS液中固定,用于免疫組織化學(xué)染色；于腦挫傷灶取腦組織-80℃液氮保存用于蛋白和總RNA的提取。應(yīng)用免疫組化SABC法和免疫印跡Western Bloting法檢測各組HIF-1α蛋白的表達,利用圖像分析技術(shù)定量測定免疫組化染色切片的陽性細(xì)胞數(shù)及以條帶積分光密度值,所得數(shù)據(jù)用用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。將提取的腦組織中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈,采用實時熒光定量PCR檢測H1F-1amRNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈的相對表達量,所得數(shù)據(jù)用用SPSS13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：(1)HE結(jié)果：對照組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,核染色較淡、圓形,核仁清楚。損傷組可見腦實質(zhì)散在出血,蛛網(wǎng)膜下腔、側(cè)腦室出血。所選切面各部位均可見程度不一的神經(jīng)元細(xì)胞核深染、固縮,神經(jīng)元細(xì)胞水腫,周圍出現(xiàn)空隙,逐漸發(fā)展為胞核破碎溶解,神經(jīng)元壞死消失,周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生；(2)免疫組織組化學(xué)SABC法染色結(jié)果：對照組神經(jīng)細(xì)胞偶見HIF-1α表達,陽性產(chǎn)物呈棕黃色,主要位于神經(jīng)細(xì)胞胞核及胞漿內(nèi)：傷后1h挫傷灶周圍即可觀察到陽性反應(yīng)細(xì)胞,呈散在少量分布；傷后12h可見表達HIF-1α的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增多,表達強度增強,差異有顯著性(P0.05)；48h后達高峰,陽性細(xì)胞聚集成簇,周圍可見大量棕黃色產(chǎn)物。隨后陽性反應(yīng)細(xì)胞逐漸減少,7d后仍見少量表達,14d后基本恢復(fù)正常；(3)免疫印跡Western Bloting結(jié)果：腦挫傷后1h即可見條帶,12h時條帶明顯增寬,48h的條帶最寬,隨后開始減少,到14d時條帶幾乎不可見。除14d組外,各實驗組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；實驗組間兩兩比較,除12h組和72h組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)外,其余各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(4)實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果：HIF-1αmRNA于腦挫傷后1h表達顯著增強(P0.01),達到高峰,為正常組的75.58倍,隨后逐漸下降,至48h時又出現(xiàn)一次高峰,隨后又開始下降,14d時降至正常水平。 結(jié)論：大鼠腦挫傷后腦組織中HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的表達隨著損傷時間的延長都呈時序性規(guī)律變化,但變化規(guī)律有所不同,HIF-1αmRNA的表達高峰出現(xiàn)較早,可用于較早損傷時間的推斷,兩者綜合分析,可望為法醫(yī)學(xué)顱腦損傷時間的推斷提供客觀、科學(xué)的依據(jù)。
【圖文】：

娜...側(cè)...州.自口口.創(chuàng).p一actin圖2大鼠腦挫傷后不同時間段HIF一la免疫印跡條帶經(jīng)內(nèi)參(p一actin)的校正，對HIF一la蛋白的表達量進行檢測，以IOD值作為相對含量(見表6)，可見腦挫傷后lh有少量HIF一la蛋白表達，6h后表達增多，，48h達到高峰，7d后降低，14d后與假手術(shù)對照組幾乎沒有差別。統(tǒng)計學(xué)分析顯示

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