【摘要】： 前言 國內(nèi)外法醫(yī)實驗室采用的DNA遺傳標(biāo)記分為兩大類:核基因組DNA和線粒體DNA(mtDNA)。與細胞核DNA相比,mtDNA有許多無法比擬的優(yōu)點,如拷貝數(shù)高、對樣木質(zhì)量要求不高、對樣木需求量低。這此特點非常適合用于細胞數(shù)量極少或嚴重降解的法庭科學(xué)生物樣本,如骨骼、毛發(fā)、指甲、微量血痕等分析。因此在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,mtDNA的應(yīng)用日益廣泛。此外,除了滿足法醫(yī)物證學(xué)個體識別和親緣關(guān)系鑒定這兩項基本要求外,它已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于法庭科學(xué)的各個方面。 近年來,mtDNA的研究不斷深入,線粒體DNA檢出在很大程度上依賴檢測方法的靈敏度,所以選擇合適的分析技術(shù)就顯得非常重要。就目前而言,在諸多的有關(guān)mtDNA的檢測方法中,直接測定序列分析是使用最多、最廣的方法。測序法要求有測序儀及相應(yīng)的試劑盒,費用昂貴,操作費時,且對操作人員本身素質(zhì)要求高,周期長,實際應(yīng)用常受到限制,在基層難以開展。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrand conformation polymorphism,SSCP)和限制性片斷長度多態(tài)性(Rrestrictionfragment length polymorphism,RFLP)技術(shù)是經(jīng)典的突變篩選技術(shù),突出特點是成本低,設(shè)備要求簡單,周期短,非常適于實驗室進行常規(guī)技術(shù)分型。 鑒于mtDNA特有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)多等特點,對降解和腐敗有更強的抵抗力,在骨骼、毛發(fā)等特殊生物檢材的法醫(yī)學(xué)檢驗中發(fā)揮了重要作用,為了建立一種適合于基層實驗室分析的技術(shù),本研究將利用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法進行線粒體DNA多態(tài)性進行分析,為法醫(yī)學(xué)個人識別、親權(quán)鑒定及群體遺傳學(xué)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 材料和方法 1、150例遼寧漢族健康無關(guān)個體及30例兩代家系血液樣品200μl、5例死后12h的各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦)0.5cm×0.5cm×0.5cm和5例甲醛固定石蠟包埋的組織切片(6μm厚)均由中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。 2、利用primer5.0設(shè)計引物,進行PCR擴增。通過PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分析線粒體DNA多態(tài)性。利用兩種技術(shù)分別對150例遼寧漢族健康無關(guān)個體進行分析,獲得單倍型頻率,并進行組織一致性檢驗以及在親權(quán)鑒定和降解檢材的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。 結(jié)果 1、用PCR-SSCP法獲得樣品清晰的單倍型圖譜,150份無關(guān)個體血樣檢出9種單倍型,DP值分別為0.8809。在150例隨機個體中,RsaI和MnlI酶切分別發(fā)現(xiàn)3和8種表型,DP值分別為0.1073,0.6698。聯(lián)合兩種酶切,發(fā)現(xiàn)12種表型,DP值為0.7078。應(yīng)用兩種技術(shù)對150例隨機個體發(fā)現(xiàn)33種組合單倍型,DP值為0.925。 2、在5例正常組織中,各個組織的RFLP帶型和SSCP帶型完全相同。 3、在30個家系中,母子的RFLP帶型和SSCP帶型完全相同。 4、5例甲醛固定包埋組織的RFLP分型和SSCP分型與對照組織一致。 結(jié)論 1、PCR-RFLP和PCR-SSCP方法用于法醫(yī)物證的初步篩查簡便、快速、經(jīng)濟,適合作為基層實驗室線粒體DNA分析的常規(guī)方法。 2、mtDNAHVI16106-16297區(qū)域在中國遼寧地區(qū)漢族具有良好的多態(tài)性分布,在法醫(yī)學(xué)上具有較高的應(yīng)用價值。 3、線粒體DNA多態(tài)性較常規(guī)STR分析更適合于甲醛固定石蠟包埋組織等非常規(guī)法醫(yī)物證檢材的DNA多態(tài)性分析。
[Abstract]:Preface
DNA genetic markers used in forensic laboratories at home and abroad can be divided into two categories: nuclear genomic DNA and mitochondrial DNA (mtDNA). Compared with nuclear DNA, mtDNA has many incomparable advantages, such as high copy number, low requirement for sample wood quality and low demand for sample wood. This feature is very suitable for courts with very few cells or serious degradation. Scientific biological samples, such as bone, hair, nails, trace bloodstains and so on, have been widely used in forensic science. In addition, besides satisfying the two basic requirements of forensic biology, such as individual identification and kinship identification, mtDNA has been more and more applied in all aspects of forensic science.
In recent years, the research of mtDNA has been deepening. The detection of mitochondrial DNA depends on the sensitivity of detection methods to a great extent, so it is very important to select the appropriate analysis technology. The instrument and its corresponding kits are expensive, time-consuming, and require high quality of the operators themselves. The practical application is often limited and difficult to carry out at the grass-roots level. Single strand conformation polymorphism (SSCP) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) The technology is a classical mutation screening technology, which is characterized by low cost, simple equipment requirements, short cycle, and very suitable for laboratory routine technical typing.
In view of the characteristics of mtDNA, such as its unique ring structure and more copies, it has a stronger resistance to degradation and corruption, and plays an important role in forensic testing of bone, hair and other special biological samples. In order to establish a suitable technology for basic-level laboratory analysis, this study will use PCR-SSCP and PCR-RFLP methods to carry out more mitochondrial DNA. Analysis of the state provides basic data for forensic personal identification, paternity testing and population genetics.
Materials and methods
The blood samples of 1,150 unrelated healthy individuals and 30 families of two generations in Liaoning Province were 200 ml. The major organs (heart, liver, spleen, lung, kidney, brain) 0.5 cm *0.5 cm *0.5 cm and 5 formaldehyde-fixed paraffin-embedded tissue sections (6 micron thick) were provided by the Forensic Medical College of China Medical University 12 hours after death.
2. Primer 5.0 was used to design primers for PCR amplification. Mitochondrial DNA polymorphisms were analyzed by PCR-SSCP and PCR-RFLP. The haplotype frequencies of 150 healthy unrelated individuals in Liaoning Han nationality were analyzed by two techniques, and the tissue consistency test was carried out.
Result
1. A clear haplotype map was obtained by PCR-SSCP. Nine haplotypes were detected in 150 unrelated blood samples with DP values of 0.8809. In 150 randomized individuals, 3 and 8 phenotypes were detected by RsaI and MLI digestion, respectively, with DP values of 0.1073 and 0.6698. Twelve phenotypes were found with DP values of 0.7078. 33 combinations of haplotypes were found in individuals, with a DP value of 0.925..
2, in 5 normal tissues, the RFLP band patterns and SSCP band patterns of all tissues were identical.
3, in the 30 families, the RFLP band pattern and the SSCP band pattern of mother and child are the same.
The RFLP typing and SSCP typing of formaldehyde fixed embedded tissues in 4,5 were consistent with those in control tissues.
conclusion
1. PCR-RFLP and PCR-SSCP are simple, rapid and economical methods for preliminary screening of forensic physical evidence. They are suitable for routine analysis of mitochondrial DNA in primary laboratories.
2. The mtDNA HVI16106-16297 region has a good polymorphism distribution in the Han nationality in Liaoning Province of China, and has a high application value in forensic medicine.
3. Mitochondrial DNA polymorphism is more suitable for DNA polymorphism analysis of unconventional forensic material such as formaldehyde fixed paraffin embedded tissue than conventional STR analysis.
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：D919

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本文編號：2187076