本文選題：法醫(yī)病理學(xué) + 腦損傷�。� 參考：《中國醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 目的 腦損傷是法醫(yī)學(xué)鑒定工作中常見的損傷類型。腦損傷機制、形成時間和程度判斷一直受法醫(yī)學(xué)工作者重視,其中腦損傷形成時間推斷對刑事案件偵查具有重要意義,然而準(zhǔn)確地推斷腦損傷時間一直是法醫(yī)學(xué)鑒定中的難題。 本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法檢測大鼠局灶性腦損傷后鈣激活中性蛋白酶1和2(calpain1和calpain2)表達(dá)情況,研究calpain1和calpain2在腦損傷修復(fù)過程中所起的作用,并對calpain1和calpain2表達(dá)變化的時間規(guī)律在推斷腦損傷形成時間方面的應(yīng)用性進(jìn)行了探討。 實驗材料與方法 一、動物模型的制作,分組與對照 雄性Sprague-Dawley大鼠50只,體重200～250g。隨機分為10組,每組5只,其中8組為實驗組,1組為對照組,1組為假手術(shù)組。動物模型采用本課題組研制的大鼠腦損傷分級自由落體打擊模型,造成大鼠局灶性腦損傷。大鼠稱重后,乙醚吸入預(yù)麻醉,2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮,在人字縫前3mm、矢狀縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗,保持硬腦膜完好。采用自由落體打擊裝置,以30g重錘從25cm高處落下,打擊暴露的腦組織。分別于傷后15min、12h、24h、3d、5d、7d、10d和15d將大鼠麻醉后脫頸椎處死,取出整腦。以損傷灶為中心冠狀切開,以備HE染色、免疫組化染色和Westernblot檢測應(yīng)用。假手術(shù)組僅行顱骨鉆孔開窗,未打擊。對照組及假手術(shù)組,以同樣方法取相同部位的腦組織作為對照。 二、免疫組織化學(xué)染色 腦組織經(jīng)4%多聚甲醛/PBS pH7.4固定液固定后,水洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作5μm厚度切片。采用鏈霉素-生物素法(SP法)進(jìn)行免疫組化染色,并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,具體步驟同試劑盒說明書。calpainl或calpain2抗體1:400稀釋,4℃孵育過夜。染色過程中另以PBS替代一抗,作為空白對照。兔抗大鼠calpain1多克隆抗體購于Abcam公司,兔抗大鼠calpain2抗體購于Sigma-Aldrich公司,SP免疫組織化學(xué)試劑盒與DAB顯色劑購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。 使用Motic Images Advanced 3.2軟件對calpain1和calpain2免疫組化染色陽性反應(yīng)物面積百分比及平均光密度值進(jìn)行檢測,統(tǒng)計分析。 三、Western blot檢測 提取腦組織蛋白并進(jìn)行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干法轉(zhuǎn)印,5%脫脂牛奶封閉,一抗(1:1000稀釋)、二抗(1:2500稀釋)孵育后,DAB顯色。以GAPDH為內(nèi)參。 應(yīng)用Fluorchem V 2.0 Stand Alone軟件獲取感光條帶的平均灰度值,進(jìn)行統(tǒng)計分析。 實驗結(jié)果 一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 對照組及假手術(shù)組腦組織均有calpain1和calpain2陽性表達(dá)。 大鼠局灶性腦損傷后,損傷周邊區(qū)calpain1表達(dá):陽性染色面積及強度于傷后逐漸增強,至傷后12h達(dá)高峰,傷后24h陽性染色逐漸減弱,傷后5d陽性表達(dá)再次增強,達(dá)另一高峰,傷后7d、10d陽性表達(dá)逐漸減弱,至15d接近對照組水平。 損傷周邊區(qū)calpain2表達(dá):陽性染色面積及強度于傷后逐漸增強,至傷后12h達(dá)高峰,傷后24h陽性表達(dá)逐漸減弱,傷后5d表達(dá)再次增強,傷后7d、10d陽性表達(dá)減弱,至15d陽性表達(dá)接近對照組。 二、Western blot結(jié)果 以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker做指示,calpain1在80kDa和58kDa處顯示陽性譜帶,calpain2在80kDa處顯示陽性譜帶,GAPDH在36kDa處顯示陽性譜帶。 Western blot結(jié)果顯示大鼠局灶性腦損傷后calpain1和calpain2蛋白的感光條帶在濃度及寬度上存在變化,其平均灰度值的變化具有一定的時間規(guī)律性并與免疫組織化學(xué)的結(jié)果相一致。 結(jié)論 本實驗采用大鼠腦損傷分級自由落體打擊模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法檢測大鼠腦損傷后calpain1和calpain2表達(dá)情況,結(jié)果表明: 1、正常大鼠腦組織中calpain1和calpain2均有表達(dá),大鼠局灶性腦損傷后,損傷周邊區(qū)calpain1和calpain2的表達(dá)隨時間而呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律,且呈較明顯的雙峰模式。 2、calpain1和calpain2的此種時間規(guī)律性變化可用于腦損傷形成時間的推斷。 3、calpain1和calpain2的此種時間規(guī)律性變化提示我們可以將calpain1和calpain2病理性激活作為基礎(chǔ)進(jìn)一步研究腦損傷后繼發(fā)性損傷的分子病理學(xué)機制。
[Abstract]:Purpose



Brain injury is a common type of injury in forensic medicine identification . The mechanism of brain injury , the formation time and the judgment of degree of brain injury have been paid much attention to by forensic scientists , in which the formation time of brain injury plays an important role in the investigation of criminal cases , however , it is difficult to accurately deduce that the time of brain injury is always the difficult problem in forensic identification .



In this experiment , the expression of neutral proteinase 1 and calca2 was detected by immunohistochemistry and Western blot . The effects of calca1 and calpain 2 on brain injury were studied .



experimental materials and methods



I . Making , grouping and control of animal models



The rats were randomly divided into 10 groups , 5 rats in each group , 8 of which were experimental group , 1 group as control group and 1 group as sham operation group .



II . IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING



Brain tissue was fixed with 4 % polyformaldehyde / PBS pH7.4 , washed with water , dehydrated with gradient alcohol , transparent in xylene , paraffin embedded , and made into slices with thickness of 5 渭m . The cells were incubated overnight at 4 鈩，

本文編號：2072246