發(fā)布時(shí)間：2018-03-29 20:57

  本文選題：法醫(yī)物證學(xué)　切入點(diǎn)：低含量組分　出處：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 混合斑是指兩名或兩名以上個(gè)體的體液、分泌液混合形成的斑痕�？梢苑譃閮深悾阂活愂怯刹煌瑐�(gè)體的同一種體液、分泌液混合而成,最常見(jiàn)為混合血痕；另一類是由不同個(gè)體的不同體液、分泌液混合而成,最常見(jiàn)為精液與陰道分泌液組成的混合斑。一個(gè)樣本中多個(gè)DNA來(lái)源個(gè)體的檢出有賴于每個(gè)個(gè)體DNA在樣本所占的比例,基因型的組合,及待擴(kuò)增樣本的DNA總量,即混合樣本DNA分型的難易程度不盡相同�；旌蠘颖局休^少成分所占的比例小于5%或1：19,通常是無(wú)法檢測(cè)到。AmpF1STR試劑盒建議,混合樣本中最少的成分應(yīng)該大于35pg,才能得到可靠的分型結(jié)果。提高混合樣本中較少組分DNA分型成功率,是法醫(yī)工作者急需解決的難題之一,同時(shí)在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)領(lǐng)域也具有重要的研究?jī)r(jià)值。SSH-PCR (Suppression Subtractive Hybridization SSH)是1996年Diatchenko等以抑制性PCR為基礎(chǔ)、并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化與消減雜交技術(shù),建立的一項(xiàng)篩選與分離未知差異表達(dá)基因的新技術(shù)。其基本過(guò)程是：抽提兩種不同細(xì)胞的差異mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用限制性內(nèi)切酶消化cDNA成平末端片段,將待研究的cDNA連接接頭后作為檢測(cè)子,將另一cDNA作為驅(qū)動(dòng)子進(jìn)行兩輪雜交,最后通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增得到差異表達(dá)的cDNA。該方法運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理,即豐度高的單鏈DNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA,從而使原來(lái)在豐度上有差別的單鏈DNA相對(duì)含量達(dá)到基本一致。而抑制PCR則是通過(guò)利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的特點(diǎn),使兩端接上具有反向末端重復(fù)序列的同一接頭的非目片段在退火時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)夾的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),無(wú)法作為模板與引物配對(duì),從而選擇性地抑制非目的基因片段的擴(kuò)增。在標(biāo)準(zhǔn)體系中,運(yùn)用SSH進(jìn)行一輪消減雜交,可富集稀有序列1000倍以上,使某些低豐度表達(dá)的mRNA有望被檢出。 鑒于SSH技術(shù)富集差異DNA序列的能力,本研究擬以PCR-STR擴(kuò)增產(chǎn)物為研究對(duì)象,直接連接接頭,并通過(guò)消減雜交和抑制PCR擴(kuò)增,提高混合檢材中較少組分DNA的分型成功率,為混合樣本的DNA分析提供一種新的方法。 材料和方法 1、血液樣品由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)血清教研室提供。 2、不同型別血液樣品分別按照1：3、1：5、1：7、1：9、1：19、1：29、1：39混合制成。 結(jié)果 1、不同型別血液樣品分別按照1：3、1：5、1：7、1：9、1：19、1：29、1：39混合后聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn),當(dāng)混合比例高于1：9時(shí),在凝膠顯色后無(wú)法觀察到明顯的條帶。這表明用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法不如毛細(xì)管電泳法靈敏,其檢出的極限比列明顯低于毛細(xì)管電泳法的1：19。 2、使用不同濃度的T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后檢測(cè),當(dāng)酶濃度為35U/μl(相當(dāng)于0.28Weiss單位)時(shí),連接效果明顯而使用其他濃度連接酶進(jìn)行連接反應(yīng),其檢測(cè)結(jié)果不明顯,在預(yù)期位置未發(fā)現(xiàn)有明顯條帶。 3、第二次雜交產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果,高含量組分被明顯抑制,在預(yù)期位置未發(fā)現(xiàn)有明顯條帶(183bp+22bp+20bp=225bp),低含量組分得到放大,在預(yù)期位置(171bp+22bp+20bp=213bp)出現(xiàn)明顯條帶。 4、不同雜交條件下,對(duì)其雜交產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)出現(xiàn)不同的結(jié)果。在預(yù)期位置(213bp)未出現(xiàn)明顯條帶。在300bp以上各泳道均出現(xiàn)不同強(qiáng)度的條帶。 結(jié)論 應(yīng)用SSH-PCR技術(shù)進(jìn)行混合樣本檢測(cè)時(shí),當(dāng)混合比例1：9時(shí)將高含量組分抑制,低含量組分被有效放大。
[Abstract]:Mixed plaque refers to the liquid and secretion of two or more individuals . It can be divided into two types : one is composed of the same kind of body fluid and secretion of different individuals , the most common is mixed bloodstain ;
A new technique for screening and isolating unknown differentially expressed genes was established by using two - stage hybridization technique .



In view of the ability of SSH to enrich the differential DNA sequence , the PCR - STR amplification product was used as the research object to directly connect the linker , and the success rate of the less component DNA in the mixed sample was improved by reducing the hybridization and inhibiting the PCR amplification , thus providing a new method for DNA analysis of the mixed sample .



Materials and Methods



1 . Blood samples are provided by the doctor ' s serum teaching and research laboratory of Chinese Medical University .



2 . The blood samples of different types were mixed with 1 : 3 , 1 : 5 , 1 : 7 , 1 : 9 , 1 : 19 , 1 : 29 , 1 : 39 , respectively .



Results



The results showed that the polyacrylamide gel electrophoresis was not as sensitive as capillary electrophoresis , and the detection limit ratio was significantly lower than that of capillary electrophoresis .



2 . After ligation with T4 DNA ligase at different concentrations , when the enzyme concentration was 35U / 渭l ( equivalent to 0.28weer unit ) , the ligation effect was obvious and the ligation reaction was carried out using other concentration ligase . The results were not obvious , and no obvious bands were found in the expected position .



3 . The results of polyacrylamide gel electrophoresis in the second hybridization showed that the high content components were obviously inhibited , and no obvious bands were found in the expected position ( 183bp + 22bp + 20bp = 225 bp ) , and the low content components were amplified , and there appeared obvious bands in the expected position ( 171bp + 22bp + 20bp = 213bp ) .



4 . The hybridization products were amplified and detected under different hybridization conditions . There were no obvious bands in the expected position ( 213bp ) . bands of different intensities appeared in each lane above 300 bp .



Conclusion



When mixed sample detection is performed using SSH - PCR technology , the high content component is suppressed and the low content component is effectively amplified when the mixing ratio is 1 : 9 .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：D919

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1682806