發(fā)布時間：2018-02-25 21:45

  本文關鍵詞： METH 內質網應激 小膠質細胞 炎癥 NF- κB　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:毒品濫用作為一個世界性的問題已引起國內外學者的高度關注,長期濫用不僅威脅個人身心健康,而且對家庭和社會也具有嚴重危害。甲基苯丙胺(methamphetamine,METH),俗稱“冰毒”,屬于一種苯丙胺類精神興奮劑(ATS),是全球濫用最為廣泛的毒品之一。METH在人體內極易通過血-腦屏障進入大腦中樞神經系統(tǒng),并迅速刺激中樞神經系統(tǒng)使之興奮性提高,長期濫用可導致成癮、認知功能損傷、神經元不可逆凋亡等神經損害。炎癥反應是長期濫用METH引起神經損傷的主要機制之一,而小膠質細胞的激活是各種刺激因素所致炎癥反應的關鍵會聚點,活化的小膠質細胞釋放大量的炎性因子和細胞毒性物質,加重多巴胺神經元的損傷甚至死亡。但是,目前關于METH誘導小膠質細胞活化的機制尚未完全闡明。內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是內環(huán)境的改變導致內質網腔中大量積聚未折疊或錯誤折疊蛋白。它能激活未折疊蛋白反應(UPR)以恢復內質網穩(wěn)態(tài),但持久且劇烈的內質網應激可誘導細胞損傷。大量研究表明,ERS信號通路的激活與炎癥反應的發(fā)生發(fā)展密切相關。然而,ERS是否參與METH誘導的炎癥反應,以及ERS在此過程中發(fā)揮著什么樣的作用仍不清楚�；谝陨涎芯勘尘�,本實驗將研究內質網應激是否在甲基苯丙胺誘導小膠質細胞活化中發(fā)揮了作用,以及介導炎性因子釋放的信號通路,為METH成癮及神經損傷的治療提供新思路。方法:1應用Western blot、Real-Time PCR(RT-PCR)方法觀察1 mM METH分別作用5 min、15 min、30 min、60 min和90 min對N9細胞GRP78蛋白及m RNA表達的影響。2應用Western blot、RT-PCR法觀察內質網應激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA,6 mM預處理60 min)與1 mM METH共同作用30 min對N9細胞GRP78蛋白及m RNA水平表達的影響。3給予6 mM 4-PBA預處理60 min后,應用Western blot方法檢測1mM METH與6 mM 4-PBA共同作用N9細胞30 min后phospho-NF-κB p65、NF-κB p65的表達變化;分別應用流式細胞術和RT-PCR方法觀察1mM METH與6 mM 4-PBA共同作用N9細胞3 h后細胞Iba1、IL-6和TNF-α的表達變化。4應用Western blot方法檢測1 mM METH分別作用5 min、15 min、30 min、60 min和90 min對N9細胞IRE1α、p-IRE1α、TRAF2、PERK、p-PERK、ATF6表達的影響,以篩選參與炎癥反應的信號機制。5應用免疫共沉淀法觀察1 mM METH與IRE1α抑制劑STF-083010(40μM)共同作用N9細胞30 min后p-IRE1α與TRAF2的相互作用;應用Western blot檢測phospho-NF-κB p65的表達;應用RT-PCR方法觀察共同作用3 h后IL-6和TNF-α的表達變化。6通過轉染小干擾RNA敲低N9細胞IRE1α后,應用Western blot檢測1 mM METH作用30 min后p-IRE1α、TRAF2、phospho-NF-κB p65表達變化;應用RT-PCR檢測1 mM METH作用3 h后IL-6和TNF-α的表達變化。7以上數據用均數±標準誤(Means±S.E.M)表示,用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析,各組均數的比較行單因素方差分析(ANOVA),以最小顯著差法(Student-Newman-Keuls,SNK)作兩兩比較,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果:1內質網應激在METH引起N9細胞活化中的作用:(1)與正常對照組相比,1 mM METH處理N9細胞30 min時,引起GRP78蛋白及m RNA水平表達顯著增加,給予4-PBA后,部分逆轉上述作用,提示METH誘導內質網應激的發(fā)生;(2)1 mM METH作用N9細胞引起Iba1、phospho-NF-κB p65、IL-6和TNF-α表達增加,給予4-PBA后,部分逆轉上述作用,提示METH可通過內質網應激誘導小膠質細胞活化和炎性因子IL-6和TNF-α的釋放。2 METH引起N9細胞活化的內質網應激相關信號通路的研究:(1)1mM METH作用N9細胞5 min、15 min、30 min、60 min和90 min后內質網應激相關信號通路IRE1α/TRAF2、PERK和ATF6均被激活,其中IRE1α/TRAF2變化最顯著,因此選擇此條通路進行后續(xù)研究;(2)免疫共沉淀結果顯示METH增加IRE1α和TRAF2的相互作用,給予IRE1α抑制劑STF-083010后二者相互作用減弱;(3)給予IRE1α抑制劑后,部分逆轉METH引起的N9細胞phospho-NF-κB p65、IL-6的表達增加,但對TNF-α無明顯作用;(4)小干擾RNA敲低IRE1α后可部分逆轉METH引起的p-IRE1α、TRAF2、phospho-NF-κB p65、IL-6和TNF-α的表達增加,提示IRE1α/TRAF2信號通路介導了METH所誘導的小膠質細胞的活化。結論:1 METH可誘導小膠質細胞發(fā)生內質網應激。2 METH可通過內質網應激介導小膠質細胞的活化與炎性因子IL-6和TNF-α的釋放。3 METH所誘導的小膠質細胞的活化與激發(fā)IRE1α/NF-κB信號通路有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：D919.4

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本文編號：1535279