發(fā)布時間：2018-02-25 17:49

  本文關(guān)鍵詞： 糖皮質(zhì)激素 慢性束縛應(yīng)激 焦慮 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 杏仁核 凋亡　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在法醫(yī)學(xué)檢案中經(jīng)常遇到受害人在遭受持續(xù)捆綁或限制體位等應(yīng)激情形后出現(xiàn)一定程度精神損傷的案件。由于此類精神損傷的分子機制尚不清楚,且缺乏客觀的評判標準,使此類應(yīng)激原與精神損傷之間的關(guān)系難以界定,常常導(dǎo)致案件久拖不決,給社會造成不良影響。因此,揭示此類應(yīng)激原導(dǎo)致精神損傷的病理分子機制具有重要的法醫(yī)學(xué)意義。杏仁核是參與情感、認知形成的腦區(qū)。毀損雙側(cè)杏仁核大鼠缺乏對恐懼事件的分辨能力。臨床影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)重度抑郁和癡呆患者杏仁核體積會發(fā)生明顯變化,提示杏仁核在控制恐懼情緒中發(fā)揮重要作用,并參與相關(guān)精神障礙的發(fā)生。膠質(zhì)細胞占據(jù)了杏仁核細胞成分的1/2,在維持杏仁核正常功能方面發(fā)揮了重要作用。有研究顯示星形膠質(zhì)細胞凋亡與許多中樞神經(jīng)損傷性及退行性病變密切相關(guān)。因此,探討應(yīng)激誘導(dǎo)杏仁核星形膠質(zhì)細胞凋亡的機制對于揭示應(yīng)激致精神損傷的分子機制具有重要意義。應(yīng)激狀態(tài)下,下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(Hypothalamic Pituitary adrenal Axis,HPA)激活,下丘腦室旁核合成和分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin Releasing Hormone,CRH)增加,CRH到達腺垂體并通過一系列細胞內(nèi)級聯(lián)放大反應(yīng)促使促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotrophic Hormone,ACTH)合成增多,ACTH到達腎上腺促進腎上腺皮質(zhì)合成和分泌糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)增加。外周血GC水平持續(xù)升高是應(yīng)激過程中非常重要的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。在垂體、下丘腦、海馬和前額葉皮質(zhì)存在糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoid receptor,MR),生理水平的GC透過血腦屏障通過與受體結(jié)合負反饋靶向約束神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活,但外周血GC水平持續(xù)增高則會產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。此外細胞學(xué)實驗證實,GC可以誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元和杏仁核神經(jīng)元凋亡。杏仁核內(nèi)膠質(zhì)細胞表面含有豐富的GC受體,增高的GC是否會透過血腦屏障作用于星形膠質(zhì)細胞上的GC受體,誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞凋亡尚未見文獻報道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是近來在凋亡機制研究中發(fā)現(xiàn)的一條新的細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路,過度激活的ERS通路最終將引發(fā)細胞凋亡。許多神經(jīng)損傷性和退行性疾病比如阿爾茨海默癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Post-traumatic stress disorder,PTSD)的發(fā)病機制均與ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。ERS是否參與GC誘導(dǎo)杏仁核星形膠質(zhì)細胞凋亡尚未見文獻報道�；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀,我們提出如下假設(shè):應(yīng)激狀態(tài)下高度分泌的GC將作用于杏仁核星形膠質(zhì)細胞導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞凋亡,而ERS在該過程中發(fā)揮了重要作用。本研究應(yīng)用大鼠慢性束縛應(yīng)激模型和體外培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細胞,從整體和細胞水平系統(tǒng)研究在應(yīng)激反應(yīng)中GC對星形膠質(zhì)細胞的損傷作用,并對其ERS機制加以深入探討,以期為應(yīng)激相關(guān)的精神損傷鑒定提供理論依據(jù)。第一部分慢性束縛應(yīng)激對大鼠杏仁核星形膠質(zhì)細胞的損傷作用目的:通過建立大鼠慢性束縛應(yīng)激模型,觀察慢性束縛應(yīng)激對大鼠杏仁核星形膠質(zhì)細胞的損傷作用。方法:建立大鼠慢性束縛應(yīng)激模型。實驗分為正常對照組和慢性束縛應(yīng)激組,慢性束縛應(yīng)激組再次分為束縛1天組、7天組、14天組和21天組。監(jiān)測各組大鼠體重及腎上腺重量的變化。應(yīng)用高架十字迷宮實驗觀察大鼠行為學(xué)變化。ELISA法檢測大鼠血清CRH、ACTH和GC濃度。應(yīng)用免疫組化方法及Western blot方法檢測杏仁核糖皮質(zhì)激素受體GR和星形膠質(zhì)細胞特異性標記蛋白GFAP表達的變化。透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察杏仁核膠質(zhì)細胞的超微結(jié)構(gòu)改變。流式細胞術(shù)AnnexinⅤ-PI雙標染色法檢測杏仁核膠質(zhì)細胞凋亡率。結(jié)果:1大鼠體重的變化:正常對照組大鼠體重逐漸增加,慢性束縛應(yīng)激組大鼠體重增加緩慢。2大鼠腎上腺的變化:與正常對照組大鼠相比,慢性束縛應(yīng)激7d組、14d組、21d組大鼠腎上腺重量明顯增加;光鏡下腎上腺皮質(zhì)顯著增寬。3 ELISA法檢測各組大鼠血清糖皮質(zhì)激素濃度的改變:與正常對照組相比,慢性束縛應(yīng)激7d、14d和21d組大鼠血清CRH水平明顯升高,慢性束縛應(yīng)激21d組大鼠血清ACTH水平明顯升高,慢性束縛應(yīng)激14d組、21d組大鼠血清GC水平顯著升高(p0.05)。4高架十字迷宮實驗結(jié)果提示各組大鼠自發(fā)運動功能無差別。與正常對照組相比,慢性束縛應(yīng)激7d組、14d組、21d組大鼠開臂停留時間百分比及進入開臂次數(shù)百分比顯著減少。5免疫組化法檢測糖皮質(zhì)激素受體GR和星形膠質(zhì)細胞標志性蛋白GFAP在大鼠杏仁核的表達:GR和GFAP的陽性信號均定位于胞漿,與正常對照組相比,慢性束縛應(yīng)激14d組、21d組大鼠杏仁核GR表達逐漸增加;而GFAP在慢性束縛應(yīng)激7d組、14d組、21d組杏仁核的表達明顯降低。6 Western blot方法檢測GR和GFAP在大鼠杏仁核的表達:與正常對照組相比,慢性束縛應(yīng)激7d組、14d組、21d組大鼠杏仁核GR明顯增加,而GFAP表達明顯降低。7透射電鏡觀察杏仁核膠質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)的改變:與正常對照組相比,慢性束縛應(yīng)激1d組到21組杏仁核腦區(qū)呈現(xiàn)不同程度的膠質(zhì)細胞損傷性變化,包括細胞水腫、核周裂增寬、線粒體嵴和膜融合、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒融合并脫顆粒、染色質(zhì)邊集、核固縮。8流式細胞術(shù)對大鼠杏仁核膠質(zhì)細胞凋亡檢測結(jié)果:與正常對照組相比,慢性束縛應(yīng)激21d組杏仁核神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡率顯著增加。小結(jié):本部分實驗成功建立了大鼠慢性束縛應(yīng)激損傷模型,模型大鼠出現(xiàn)明顯的焦慮樣行為學(xué)改變,杏仁核GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)目顯著減少,GR表達明顯增加,杏仁核膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了凋亡性的超微結(jié)構(gòu)改變,杏仁核膠質(zhì)細胞凋亡率明顯增加。第二部分糖皮質(zhì)激素對慢性束縛應(yīng)激大鼠杏仁核星形膠質(zhì)細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志蛋白表達的影響目的:通過觀察慢性束縛應(yīng)激大鼠杏仁核星形膠質(zhì)細胞凋亡現(xiàn)象及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白GRP78、CHOP和Caspase 12的表達,研究星形膠質(zhì)細胞的凋亡機制。方法:實驗分為4組,正常對照組(Con組),慢性束縛應(yīng)激組(CRS組),GC受體拮抗劑組(RU486組,慢性束縛應(yīng)激+RU486),溶劑對照組(propylene glycol組,慢性束縛應(yīng)激+丙二醇)。應(yīng)用高架十字迷宮實驗觀察大鼠行為學(xué)變化。采用免疫組化檢測GFAP和S100β的表達;采用免疫組化和Western blot方法檢測杏仁核星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP、S100β蛋白的表達,應(yīng)用Western blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志分子GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白的表達;流式細胞術(shù)AnnexinⅤ-PI雙標染色法檢測杏仁核膠質(zhì)細胞凋亡率。結(jié)果:1與Con組相比,CRS組大鼠開臂停留時間百分比及進入開臂次數(shù)百分比顯著減少;與CRS組相比,RU486組大鼠開臂停留時間百分比及進入開臂次數(shù)百分比明顯增加;CRS組與propylene glycol組相比,兩組無明顯差別。各組大鼠自發(fā)運動功能無明顯差別。2免疫組化法及Western blot法檢測GFAP和S100β蛋白在大鼠杏仁核的表達:免疫組化結(jié)果顯示,與Con組相比,CRS組大鼠杏仁核GFAP和S100β陽性細胞數(shù)目均明顯減少;與CRS組相比,RU486組的GFAP和S100β陽性細胞數(shù)目增加,而CRS組與propylene glycol組相比無明顯差別。Western blot檢測結(jié)果趨勢與免疫組化法相似,與Con組相比,CRS組大鼠杏仁核GFAP和S100β表達均明顯減少;與CRS組相比,RU486組的GFAP和S100β表達增加,而CRS組與propylene glycol組相比無明顯差別。3 Western blot法檢測GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白在大鼠杏仁核的表達:與Con組相比,CRS組大鼠杏仁核GRP78、CHOP、Caspase 12表達均明顯增加;與CRS組相比,RU486組的GRP78、CHOP、Caspase12表達顯著減少,而CRS組與propylene glycol組相比無明顯差別。4流式細胞術(shù)AnnexinⅤ-PI雙標染色法檢測杏仁核細胞凋亡:與Con組相比,CRS組細胞凋亡率明顯升高;與CRS組相比,RU486組的凋亡率明顯下降;CRS組與propylene glycol組相比無明顯差別。小結(jié):GC可以誘導(dǎo)慢性束縛應(yīng)激大鼠杏仁核星形膠質(zhì)細胞凋亡,其作用機制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。第三部分地塞米松誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制目的:觀察地塞米松(Dexamethasone,DEX)對人星形膠質(zhì)細胞(Human astrocytes,HA)凋亡的影響,并對其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制及通路進行深入探討。方法:1培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細胞,免疫熒光法檢測GR表達。2采用MTT實驗檢測不同濃度的DEX(10-9 M~10-5 M)對星形膠質(zhì)細胞存活率的影響;3 Western blot方法檢測檢測GFAP、S100β、GRP78、CHOP、Caspase12的表達;采用Western blot方法檢測p-PERK、p-e IF2α、ATF4蛋白表達情況。流式細胞術(shù)AnnexinⅤ-PI雙標染色法檢測細胞凋亡率。4觀察CHOP敲低對DEX所致星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響。10-6M的DEX處理前給予CHOP siRNA,Western blot方法檢測CHOP蛋白的表達以驗證轉(zhuǎn)染效率,流式細胞術(shù)AnnexinⅤ-PI雙標染色法檢測細胞凋亡率。結(jié)果:1 HA細胞GR的表達情況:HA細胞表達GR,陽性部位位于細胞漿。2與Con組相比,10-9 M~10-5 M的DEX作用HA細胞48 h后,細胞存活率明顯降低。3與Con組相比,10-6 M的DEX作用于HA細胞6h后,細胞凋亡率明顯升高,DEX+RU486組與DEX組相比凋亡率明顯下降。單獨應(yīng)用RU486組與CON組相比無明顯差別。4與Con組相比,DEX組GRP78、CHOP、Caspase 12的蛋白水平均明顯增高;與DEX組相比DEX+RU486組上述蛋白表達下降。單獨應(yīng)用RU486組與Con組相比無明顯差別。5與Con組相比,DEX組p-PERK、p-e IF2α、ATF4蛋白表達均明顯增高,而與DEX組相比DEX+RU486組上述蛋白表達下降。單獨應(yīng)用RU486組與Con組相比無明顯差別。6與DEX組相比,DEX+CHOP siRNA組CHOP蛋白表達明顯減少,證明細胞轉(zhuǎn)染成功。與DEX處理組相比,CHOP siRNA處理組細胞凋亡率明顯下降,CHOP siRNA明顯逆轉(zhuǎn)了DEX誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞凋亡;而control siRNA處理組與DEX組處理組相比無明顯差別。小結(jié):DEX可獨立誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細胞凋亡,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP途徑可以抑制DEX誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞凋亡的發(fā)生,提示GC通過與受體結(jié)合,激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激p-PERK/p-e IF2α/ATF4/CHOP通路,誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細胞凋亡。綜上,本實驗通過建立大鼠慢性束縛應(yīng)激損傷模型和體外培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細胞,系統(tǒng)研究了糖皮質(zhì)激素對星形膠質(zhì)細胞的影響,證實糖皮質(zhì)激素在束縛應(yīng)激導(dǎo)致杏仁核星形膠質(zhì)細胞損傷的過程中發(fā)揮了重要作用,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了這一過程。正確評價糖皮質(zhì)激素在應(yīng)激反應(yīng)中的作用,可為應(yīng)激所致精神損害的法醫(yī)學(xué)鑒定和治療提供一定的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：D919

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號：1534559