本文關(guān)鍵詞： 法醫(yī)病理學(xué) 腦挫傷 Homer蛋白　出處：《中國醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 前言 腦是人體的生命中樞,是最易受損的器官。腦損傷在法醫(yī)鑒定工作中很常見,且隨著經(jīng)濟(jì)和交通的迅速發(fā)展,創(chuàng)傷性顱腦損傷的發(fā)生率逐年升高,已經(jīng)嚴(yán)重威脅人們的生命健康。因此關(guān)于腦損傷時間、機(jī)制、損傷程度的研究就顯得非常重要。Homer蛋白是突觸后密度蛋白家族成員之一,它是聯(lián)系突觸內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白、信號蛋白的重要物質(zhì)。最初在神經(jīng)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn),它在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸形成、受體轉(zhuǎn)運(yùn)和受體細(xì)胞內(nèi)定位起重要作用。癲癇、高頻刺激、損傷及發(fā)育等興奮性突觸活動可誘導(dǎo)Homer蛋白表達(dá)增加。目前為止,顱腦損傷機(jī)制方面的研究很多,其中機(jī)制之一是通過代謝性谷氨酸受體(mGluRs)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放導(dǎo)致神經(jīng)元損傷；有研究發(fā)現(xiàn),Homer蛋白在代謝性谷氨酸受體引起的神經(jīng)元損傷中起到重要作用；另有研究發(fā)現(xiàn),在彌漫性顱腦損傷動物模型中Homer蛋白表達(dá)增加,因此有必要利用腦損傷模型,進(jìn)一步觀察Homer蛋白表達(dá)變化規(guī)律,完善Homer蛋白在各種腦損傷模型中的研究,為腦損傷時間推斷法醫(yī)鑒定提供參考依據(jù)。 材料與方法 一、動物模型的制作,分組與對照 雄性Wistar大鼠50只,體重220-250g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。隨機(jī)分為10組,其中包括8個實驗組,1個正常對照組,1個假手術(shù)組,每組5只大鼠。實驗組采用吳旭等研制的大鼠腦挫傷模型制作方法,制造大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型。乙醚吸入預(yù)麻醉,大鼠稱重后,2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。正中切開大鼠頂部頭皮,在人字縫前3mm,矢狀縫旁3mm處鉆直徑為5mm的圓形骨窗,保持硬腦膜完好,采用自由落體打擊裝置,以30g重錘從25cm高處落下,打擊暴露的腦組織；假手術(shù)組以相同的方法鉆孔,但不進(jìn)行打擊。術(shù)后動物分籠飼養(yǎng),保持墊料清潔及空氣通暢。于傷后0.5、3、6、12h和1、3、5、7d將大鼠乙醚麻醉后脫頸椎處死。手術(shù)取出腦組織,沿冠狀方向?qū)⒋靷麉^(qū)平均分為兩部分,并對損傷周邊區(qū)進(jìn)行取材、修塊,一份用于免疫組化染色,另一份用于Western blot檢測。對照組和假手術(shù)組以同樣方法取相同部位的腦組織作為對照。 二、免疫組織化學(xué)染色 腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,水洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作5μm厚度切片。采用鏈霉素-生物素法(SP法)進(jìn)行免疫組化染色,并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,具體步驟同試劑盒說明書。Homer單克隆一抗(1：200)稀釋,4℃孵育過夜。染色過程中另以一抗稀釋液替代一抗,作為陰性對照。小鼠來源Homer(D-3)單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology,小鼠SP免疫組織化學(xué)試劑盒(SP-9002)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 三、Western blot檢測 對用于Western blot的腦組織進(jìn)行裂解、勻漿、離心,提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干法轉(zhuǎn)印,5%脫脂牛奶封閉,一抗(1：800稀釋)、二抗(1：5000稀釋)孵育后,DAB顯色。實驗中以GADPH為內(nèi)參。 實驗結(jié)果 一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 對照組及假手術(shù)組神經(jīng)元胞漿中可見少量Homer蛋白表達(dá),陽性染色較淡。實驗組中,腦挫傷后0.5h、3h組挫傷周邊區(qū)可見陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多,胞漿內(nèi)Homer蛋白表達(dá)增多,陽性染色較深；6h、12h、1d組陽性細(xì)胞數(shù)維持在較高水平,傷后12h組陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰,隨后3d組可見陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降,5d、7d組基本降至基礎(chǔ)水平,并可見陽性細(xì)胞染色較淡。 二、Western blot結(jié)果 對照組及假手術(shù)組可見少量Homer蛋白表達(dá)；腦挫傷后0.5h、3h組可見Homer蛋白表達(dá)增加,6h、12h、1d組Homer蛋白表達(dá)維持較高水平。12h組達(dá)到高峰,隨后3d組下降,5d、7d組降至基礎(chǔ)水平。取損傷后不同時間段條帶的平均光密度值,經(jīng)統(tǒng)計分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 本實驗在建立大鼠局灶性閉合性腦挫傷模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western blot方法檢測大鼠腦挫傷后Homer蛋白表達(dá)。結(jié)果表明： 1、正常大鼠腦組織中有少量Homer蛋白的表達(dá)。 2、Homer蛋白在腦挫傷后挫傷周邊區(qū)隨時間延長表達(dá)增多,傷后12h達(dá)到高峰,隨后表達(dá)逐漸減少,5d、7d恢復(fù)至基礎(chǔ)水平,呈單峰變化。 3、大鼠局灶性腦挫傷后Homer蛋白表達(dá)呈時間相關(guān)性變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：D919

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本文編號：1474812