前 言

損傷時(shí)間推斷是根據(jù)人體形態(tài)學(xué)及別的檢測(cè)技術(shù)對(duì)損傷產(chǎn)生的時(shí)間進(jìn)行分析推斷的過程，是法醫(yī)學(xué)工作的重要內(nèi)容，目的是為了區(qū)分尸體上的損傷為生前損傷還是死后損傷及傷后存活時(shí)間的推斷，為劃定嫌疑人的活動(dòng)或意圖提供線索，有益于案件的重建[1]。隨著經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、及交通等各方面的發(fā)展，腦損傷的發(fā)生率呈不斷上升趨勢(shì)，腦損傷是最為常見的暴力機(jī)械性損傷，大量文獻(xiàn)報(bào)道腦損傷死亡率高達(dá)23.4%～44.7%[2-3]。 所以，腦損傷也成為國內(nèi)外法醫(yī)病理學(xué)研究的主要死因之一。以往腦損傷時(shí)間的推斷是以損傷后腦組織常規(guī)病理學(xué)形態(tài)改變?yōu)橐罁?jù)的[4-6]，隨著醫(yī)學(xué)及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和相互滲透，法醫(yī)病理學(xué)也進(jìn)入了快速發(fā)展時(shí)代，已經(jīng)可以充分運(yùn)用免疫組織化學(xué)[7]、原位雜交和圖像分析等技術(shù)[8]將腦損傷的研究發(fā)展到超微及分子水平[9].越來越多的研究顯示，腦損傷一段時(shí)間內(nèi)可以觸發(fā)一系列的形態(tài)及生化反應(yīng)，使腦組織發(fā)生遲發(fā)性損害，現(xiàn)已知約有2萬種蛋白質(zhì)基因在腦內(nèi)特異性表達(dá)。隨著研究的不斷深化，損傷時(shí)間的推斷也將更加精準(zhǔn)。內(nèi)皮素（Endothelin，簡稱 ET）是上世紀(jì) 80 年代由日本學(xué)者 Yanagisawa[10]等從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離出的一種活性肽，其由 21 種氨基酸構(gòu)成，是迄今研究人體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)之一。研究證明，人體內(nèi)存在三種 ET 基因，分別為ET-1、ET-2、ET-3，它們分別由不同的基因編碼，ET-1 是唯一存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮素。ET-1 是內(nèi)皮素家族中含量最多而且功能最主要的一種。
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材料和方法

1 材料
健康成年 SD 大鼠 64 只，雌雄不限，體重 250g-300g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
主要試劑
麻醉劑 10%水合氯醛
抗凝劑 10% EDTAPBS
緩沖液 武漢博士德生物工程有限公司
大鼠內(nèi)皮素 1 放射免疫分析藥盒
125I-ET-1 試劑盒
大鼠內(nèi)皮素 1(ET-1)ELISA 試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司

2 方法
參照 Feeney’s 法[11]建立大鼠腦損傷模型，大鼠稱重后，以 10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，采取俯臥位固定于打擊臺(tái)上，將大鼠頂枕部常規(guī)消毒備皮，于正中線處將頭皮切約 4cm 切口，剝離骨膜，以人字縫前 3mm，顱骨正中線旁 3mm處用骨鉆鉆一直徑約為 5mm 的圓形骨窗，使硬腦膜充分暴露，并保持完好，自制一打擊墊放入骨窗，模擬自由落體打擊裝置，以 50g 砝碼沿導(dǎo)管于 40cm 高處落下打擊骨窗處，觀察片刻后以骨臘封閉骨窗，縫合頭皮。正常組不做任何處理，對(duì)照組 SD 大鼠僅做鉆孔處理，不做自由落體打擊，，不致腦損傷。遂將大鼠置于室內(nèi)安靜、清潔的鼠籠中進(jìn)行正常飼養(yǎng)，然后依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)損傷時(shí)間點(diǎn)取材并將大鼠處死。損傷組大鼠受高處自由落體重物打擊后，見骨窗內(nèi)腦組織突起并有少量出血，出現(xiàn)小便失禁及肌張力增高的表現(xiàn)，出現(xiàn)一定程度的瞳孔改變，肢體抽搐及意識(shí)障礙，各種生理反射包括瞳孔對(duì)光反射、角膜反射、睫毛反射及刺痛反應(yīng)消失，傷后各項(xiàng)反射消失超過 30 分鐘內(nèi)恢復(fù)認(rèn)為模型制作成功。

材料和方法.............6
實(shí)驗(yàn)結(jié)果...............10
討論..........................12
結(jié)論.........................14

討 論

1 內(nèi)皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)
內(nèi)皮素（ET）是由日本學(xué)者Yanagisawa在1988年首次從豬動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離出的一種由21個(gè)氨基酸組成的血管活性肽物質(zhì)，Inoue等[15]用基因Southern分析技術(shù),明確人體內(nèi)有三種ET基因分別編碼ET-1、ET-2、ET-3三種異構(gòu)肽，它們結(jié)構(gòu)相似，氨基酸序列具有很高的同源性，都具有相同的氨基酸殘基組成的疏水性C末端，鏈內(nèi)有兩個(gè)雙硫鍵（1-15和3-11位之間）[16]。但ET-2、ET-3與ET-1相比，分別有2個(gè)和6個(gè)氨基酸不同。三種ET異構(gòu)肽氨基酸序列圖如（附錄二圖1）[17]所示。在人體內(nèi)，ET-1的含量最高，ET-1主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，ET-2在腎臟表達(dá)，而ET-3主要在神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟中進(jìn)行表達(dá)。

2 內(nèi)皮素的作用機(jī)制
ET通過與特異受體結(jié)合，激活磷脂酶C（PLC），生成三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG），隨之生成四磷酸肌醇（IP4），IP3促使胞內(nèi)Ca2+釋放，而IP4則引起細(xì)胞膜鈣通道開放，造成胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載，但與此同時(shí)，又激活蛋白激酶C（PKC），使Ca2+由胞內(nèi)向胞外泵出，降低胞內(nèi)Ca2+濃度，維持相對(duì)的穩(wěn)態(tài)。在生理?xiàng)l件下，內(nèi)皮素發(fā)揮著調(diào)節(jié)血管張力和微循環(huán)血流灌流[18]的作用。在化學(xué)和機(jī)械刺激下均可誘導(dǎo)ET的合成，ET幾乎參與了機(jī)體所有的應(yīng)激炎癥反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體受到某種應(yīng)激刺激時(shí)，通過細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致內(nèi)皮素增加[19]。ET最顯著地作用是縮血管作用，另外還具有正性心肌力，刺激釋放多種激素，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞的增殖作用。ET在心血管，神經(jīng)，內(nèi)分泌，消化，呼吸系統(tǒng)以及腫瘤等疾病的進(jìn)程中也發(fā)揮著重要的作用[20-23]。
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結(jié) 論

1 本實(shí)驗(yàn)參照 Feeneys 法，成功復(fù)制了自由落體打擊致腦損傷的大鼠模型。2 本實(shí)驗(yàn)采用兩種檢測(cè)方法，共同驗(yàn)證了腦損傷后血漿 ET-1 的顯著表達(dá)，表明腦損傷可誘導(dǎo)血漿 ET-1 的合成，但隨損傷時(shí)間的不同，ET-1 的含量表達(dá)程度不同，表明血漿 ET-1 的表達(dá)與損傷時(shí)間有一定關(guān)聯(lián)性。3 有研究表明，正常人血漿 ET-1 的水平隨年齡的增長而有所增高[38]，可認(rèn)為是血漿 ET-1 用于法醫(yī)實(shí)踐中腦損傷時(shí)間推斷的影響因素。4 還有研究表明，腦損傷后患者血漿內(nèi)皮素水平升高，與損傷程度有關(guān)[39-41]。故 ET-1 含量作為腦損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)還需結(jié)合損傷程度綜合分析。血漿 ET-1 可作為日后法醫(yī)損傷時(shí)間推斷的一項(xiàng)指標(biāo)，但其存在單一性和局限性，還需結(jié)合更多敏感性指標(biāo)來準(zhǔn)確推斷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在多種不可抗拒因素和樣本的局限性，統(tǒng)計(jì)學(xué)上可能存在誤差。所以與實(shí)際運(yùn)用還存在著差距�？傊�，血漿 ET-1 用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，還有待進(jìn)一步的探索和研究。
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參考文獻(xiàn)（略）