本文關鍵詞：絕經后骨質疏松癥及補腎方治療后全基因組微小RNA表達譜研究

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【摘要】：絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種發(fā)生于絕經后婦女的全身性骨代謝疾病,以骨脆易于發(fā)生骨折為特點。隨著人類壽命的延長,婦女絕經后仍然有數十年的生命過程,但骨質疏松癥當前已是中老年女性退行性疾病中一常見病、多發(fā)病,嚴重威脅其生存質量、身心健康。因此,預防和治療絕經后骨質疏松是我們需要共同面對的健康問題。補腎方是中醫(yī)臨床對腎虛型絕經后骨質疏松癥主要的、常用的、有效的治療方法,廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院院內制劑骨康方是治療PMOP的驗方,溫補腎陽、強筋壯骨、益氣健脾、活血通絡；中醫(yī)傳統(tǒng)經方六味地黃丸和金匱腎氣丸分別是偏補腎陰虛和腎陽虛的的常用方和基礎方,但這些補腎方的分子機制和靶點治療尚不清楚,有待闡明。微小RNA (microRNA,miRNA)是一些短小的非編碼RNAs,能介導基因的轉錄后沉默,與細胞增殖分化遷移、疾病的發(fā)生和進展都有關系,骨組織的生長、代謝同樣與miRNA密切相關。與骨代謝相關的miRNA表達水平變化會引起骨質代謝異常,導致骨質疏松等骨病的發(fā)生。miRNA廣泛存在于人體體液中,因此,通過檢測循環(huán)中miRNA的變化,可為疾病的診斷和治療提供潛在的可能性。本研究應用高通量測序技術,對比正常和絕經后骨質疏松的動物模型血漿中miRNA的表達情況,對比PMOP模型與經補腎方灌胃治療后的動物模型血漿中miRNA的表達變化,判斷miRNA在PMOP發(fā)病機制及補腎方治療中的作用；并對差異顯著的miRNA進行生物信息學分析,為以其為靶點的基因治療提供理論和實驗基礎。本研究將為絕經后骨質疏松癥提供一個新的有潛力的預防診斷標記、預后標記和治療靶點。目的：1.檢測絕經后骨質疏松癥動物模型與正常對照組血漿全基因表達譜,篩選差異表達的miRNAs,從中尋找起關鍵調控作用的差異表達的miRNAs,推測能夠作為疾病生物標志物的miRNAs,為PMOP的病機研究和診斷提供理論依據。2.檢測PMOP與三種補腎方治療后PMOP動物血漿全基因表達譜,分別篩選差異表達的miRNAs,探討補腎方治療PMOP的可能機制及三種補腎方治療機制的異同。3.對差異表達顯著的miRNA進行生物信息學分析,明確miRNA表達水平的變化可能是骨質疏松發(fā)生的重要通路；探討miRNA參與補腎方治療PMOP的可能作用途徑靶點。方法：1.將六月齡體質量180-220g的SD大鼠隨機分為假手術(SHAM)和卵巢切除術(OVX)兩組。SPF級實驗室適應性喂養(yǎng)一周后,OVX組經背部切除雙側卵巢,SHAM組在卵巢附近切除等量脂肪組織。術后12周經骨密度檢測等統(tǒng)計分析確定絕經后骨質疏松癥動物模型建立成功。2.將PMOP模型組大鼠隨機分為PMOP模型組(PMOP組)、骨康方治療組(PMOP+GK組)、六味地黃丸治療組(PMOP+ LW組)及金匱腎氣丸治療組(PMOP+JG組)。三組補腎方治療組分別給予骨康方煎劑、六味地黃煎劑、金匱腎氣丸煎劑按照中劑量生藥4.8g/kg、12.6g/kg、12.6g/kg大鼠體質量灌胃,每天一次；SHAM組和PMOP組給予等量的生理鹽水灌胃,每天一次。持續(xù)灌胃12周后,骨密度檢測確定補腎方治療有效,對各組大鼠進行腹主動脈采血,分離血漿備用。3.TRIzol LS試劑提取各組血漿樣本總RNA,總RNA在T4RNA連接酶的作用下加上3′、5′small RNA測序接頭,所得產物經RT-PCR擴增以及聚丙烯酰胺凝膠電泳純化生成small RNAs文庫,并進行文庫質量分析,使用Illumina cBot簇生成系統(tǒng)進行測序文庫的克隆擴增,應用Illumina高通量測序儀對SHAM組、PMOP組、PMOP+GK組、PMOP+LW組和PMOP+JG組SD大鼠血漿樣本中的miRNA進行全基因組表達譜檢測,原始數據處理后分別比較其mi RNA表達的差異。4.運用三個目前最主要的mi RNA靶基因數據庫：TargenScarumirbase 和miRanda對差異顯著的miRNAs進行靶基因分析,篩選出數據庫重疊的miRNA靶基因作為最終miRNA靶基因；基于GO數據庫對miRNAs進行功能分類,將其歸類至相應的生物過程、分子功能和細胞組分中；從GO注釋中追蹤KEGG信號通路的信息,繼續(xù)富集這些表達差異顯著的miRNAs至對應的信號通路。成果：1.PMOP組樣本與SHAM組對照樣本之間差異表達的miRNA共829種,在PMOP組呈表達上調的有383種,其中17種顯著上調,差異比值最大的miRNA為rno-miR-206-3p(比值4.5)；呈表達下調的有446種,其中37種顯著下調,差異比值最低的mi RNA為rno-miR-152-3p(比值0.2)。2. PMOP+GK組與PMOP組對照樣本之間差異表達的miRNA共617種,在PMOP+GK組呈表達上調的有192種,其中41種顯著上調,差異比值最大的miRNA為rno-let-7i-5p(比值22.1)；呈表達下調的有425種,其中31種顯著下調,差異比值最低的miRN A為rno-miR-206-3p(比值0.02)。3.PMOP+LW組與PMOP組對照樣本之間差異表達的miRNA共606種,在PMOP+LW組呈表達上調的有102種,其中2種顯著上調,差異比值最大的miRNA為rno-miR-novel-chr6_36168(比值3.6)；呈表達下調的有504種,其中47種顯著下調,差異比值最低的miRNA為 rno-miR-novel-chr14_8300比值0.04)。4.PMOP+JG組與PMOP組對照樣本之間差異表達的miRNA共619種,在PMOP+JG組呈表達上調的有191種,其中64種顯著上調,差異比值最大的miRNA為rno-mi R-144-5p(比值35.9)；呈表達下調的有428種,其中34種顯著下調,差異比值最低的miRNA為rno-miR-122-5p(比值0.005)。5.靶基因分析：篩選出三種補腎方共同差異表達的miRNAs,即三個補腎方同時下調的5個miRNAs:rno-miR-100-5p, rno-miR-novel-chr14_8432、 rno-miR-novel-chr14_8912、rno-miR-novel-chr14_9053、 rno-mi R-novel-chrl_19071,與SHAM組相比他們在PMOP組都顯著上調。五個miRNAs的靶基因做整合分析,發(fā)現交聯最多的靶基因有：Panx2、RGD156116l Grinl、Plekhg5、 Elk4、Cx3cll RGD1311447、Tnfrsf2、Socsl Mmp9、Ctxnl、Dixdcl、Dbt、Sgsm2、 Pbx2; rno-miR-100-5p的靶基因有157個,其中篩選出Mtmr3、Acerl、Shank2。6.信號通路分析：這些靶基因涉及骨代謝的多個細胞通路,根據富集得分,其中與骨代謝密切相關的三條通路：MAPK信號通路、Wnt信號通路和破骨細胞分化通路,對應其詳細靶基因信息,找到5個miRNAs中與其密切相關的靶基因：MAPK信號通路中的基因E1k4和破骨細胞分化通路中的基因Socsl。結論：1、絕經后骨質疏松癥大鼠血漿與正常血漿相比伴有一系列miRNA表達水平的改變,經GO功能分析和Pathway分析,miRNA表達水平的變化可能是引發(fā)PMOP的重要通路。2、補腎方可能通過下調PMOP大鼠血漿中miR-100-5p或四個新的miRNA (miR-novel-chr14_8432、miR-novel-chr14_8912、rno-miR-novel-chrl4_9053、 rno-miR-novel-chrl_19071)的表達水平,刺激其調控MAPK信號通路中的基因Elk4和破骨細胞分化通路中的基因Socsl的表達,從而起到抗骨質疏松的作用。
【關鍵詞】：中醫(yī)中藥 絕經后骨質疏松癥 微小RNA Illumina測序 表達譜
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R259
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-13
• 引言13-15
• 第一部分 文獻研究15-27
• 1.1 中醫(yī)藥與絕經后骨質疏松癥研究進展15-17
• 1.1.1 病因病機研究15-16
• 1.1.2 辯證論治研究16
• 1.1.3 補腎方應用研究16-17
• 1.1.4 中醫(yī)藥研究中存在的問題17
• 1.2 現代醫(yī)學與絕經后骨質疏松癥研究進展17-19
• 1.2.1 病因病機研究18
• 1.2.2 現代治療研究18-19
• 1.2.3 研究中存在的問題19
• 1.3 miRNA與絕經后骨質疏松癥的研究進展19-26
• 1.3.1 miRNA的產生與作用機制19-20
• 1.3.2 miRNA的生物學功能研究20-21
• 1.3.3 miRNA的研究技術方法21-24
• 1.3.4 miRNA在絕經后骨質疏松癥研究中的應用24-26
• 1.3.4.1 miRNA作為絕經后骨質疏松癥的生物標志物24-25
• 1.3.4.2 miRNA作為絕經后骨質疏松癥的治療靶點的可能性25-26
• 1.4 小結26-27
• 第二部分 實驗研究27-49
• 2.1 絕經后骨質疏松癥及補腎方干預后血漿miRNA表達譜研究27-40
• 2.1.1 材料與方法27-32
• 2.1.1.1 實驗材料27-28
• 2.1.1.2 實驗方法28-32
• 2.1.2 結果32-39
• 2.1.3 討論39-40
• 2.2 差異表達miRNA生物信息學分析40-49
• 2.2.1 材料與方法41-42
• 2.2.2 結果42-47
• 2.2.3 討論47-49
• 結語49-51
• 參考文獻51-55
• 附錄55-57
• 在校期間發(fā)表論文情況57-58
• 致謝58

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1 沈偉;徐e，

本文編號：961613