發(fā)布時(shí)間：2017-10-02 20:20

  本文關(guān)鍵詞：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及補(bǔ)腎方治療后全基因組微小RNA表達(dá)譜研究

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【摘要】：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種發(fā)生于絕經(jīng)后婦女的全身性骨代謝疾病,以骨脆易于發(fā)生骨折為特點(diǎn)。隨著人類壽命的延長(zhǎng),婦女絕經(jīng)后仍然有數(shù)十年的生命過(guò)程,但骨質(zhì)疏松癥當(dāng)前已是中老年女性退行性疾病中一常見(jiàn)病、多發(fā)病,嚴(yán)重威脅其生存質(zhì)量、身心健康。因此,預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是我們需要共同面對(duì)的健康問(wèn)題。補(bǔ)腎方是中醫(yī)臨床對(duì)腎虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要的、常用的、有效的治療方法,廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑骨康方是治療PMOP的驗(yàn)方,溫補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨、益氣健脾、活血通絡(luò)；中醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)方六味地黃丸和金匱腎氣丸分別是偏補(bǔ)腎陰虛和腎陽(yáng)虛的的常用方和基礎(chǔ)方,但這些補(bǔ)腎方的分子機(jī)制和靶點(diǎn)治療尚不清楚,有待闡明。微小RNA (microRNA,miRNA)是一些短小的非編碼RNAs,能介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄后沉默,與細(xì)胞增殖分化遷移、疾病的發(fā)生和進(jìn)展都有關(guān)系,骨組織的生長(zhǎng)、代謝同樣與miRNA密切相關(guān)。與骨代謝相關(guān)的miRNA表達(dá)水平變化會(huì)引起骨質(zhì)代謝異常,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨病的發(fā)生。miRNA廣泛存在于人體體液中,因此,通過(guò)檢測(cè)循環(huán)中miRNA的變化,可為疾病的診斷和治療提供潛在的可能性。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)比正常和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型血漿中miRNA的表達(dá)情況,對(duì)比PMOP模型與經(jīng)補(bǔ)腎方灌胃治療后的動(dòng)物模型血漿中miRNA的表達(dá)變化,判斷miRNA在PMOP發(fā)病機(jī)制及補(bǔ)腎方治療中的作用；并對(duì)差異顯著的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為以其為靶點(diǎn)的基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究將為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供一個(gè)新的有潛力的預(yù)防診斷標(biāo)記、預(yù)后標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。目的：1.檢測(cè)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型與正常對(duì)照組血漿全基因表達(dá)譜,篩選差異表達(dá)的miRNAs,從中尋找起關(guān)鍵調(diào)控作用的差異表達(dá)的miRNAs,推測(cè)能夠作為疾病生物標(biāo)志物的miRNAs,為PMOP的病機(jī)研究和診斷提供理論依據(jù)。2.檢測(cè)PMOP與三種補(bǔ)腎方治療后PMOP動(dòng)物血漿全基因表達(dá)譜,分別篩選差異表達(dá)的miRNAs,探討補(bǔ)腎方治療PMOP的可能機(jī)制及三種補(bǔ)腎方治療機(jī)制的異同。3.對(duì)差異表達(dá)顯著的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析,明確miRNA表達(dá)水平的變化可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要通路；探討miRNA參與補(bǔ)腎方治療PMOP的可能作用途徑靶點(diǎn)。方法：1.將六月齡體質(zhì)量180-220g的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(SHAM)和卵巢切除術(shù)(OVX)兩組。SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,OVX組經(jīng)背部切除雙側(cè)卵巢,SHAM組在卵巢附近切除等量脂肪組織。術(shù)后12周經(jīng)骨密度檢測(cè)等統(tǒng)計(jì)分析確定絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型建立成功。2.將PMOP模型組大鼠隨機(jī)分為PMOP模型組(PMOP組)、骨康方治療組(PMOP+GK組)、六味地黃丸治療組(PMOP+ LW組)及金匱腎氣丸治療組(PMOP+JG組)。三組補(bǔ)腎方治療組分別給予骨康方煎劑、六味地黃煎劑、金匱腎氣丸煎劑按照中劑量生藥4.8g/kg、12.6g/kg、12.6g/kg大鼠體質(zhì)量灌胃,每天一次；SHAM組和PMOP組給予等量的生理鹽水灌胃,每天一次。持續(xù)灌胃12周后,骨密度檢測(cè)確定補(bǔ)腎方治療有效,對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血,分離血漿備用。3.TRIzol LS試劑提取各組血漿樣本總RNA,總RNA在T4RNA連接酶的作用下加上3′、5′small RNA測(cè)序接頭,所得產(chǎn)物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增以及聚丙烯酰胺凝膠電泳純化生成small RNAs文庫(kù),并進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量分析,使用Illumina cBot簇生成系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的克隆擴(kuò)增,應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序儀對(duì)SHAM組、PMOP組、PMOP+GK組、PMOP+LW組和PMOP+JG組SD大鼠血漿樣本中的miRNA進(jìn)行全基因組表達(dá)譜檢測(cè),原始數(shù)據(jù)處理后分別比較其mi RNA表達(dá)的差異。4.運(yùn)用三個(gè)目前最主要的mi RNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)：TargenScarumirbase 和miRanda對(duì)差異顯著的miRNAs進(jìn)行靶基因分析,篩選出數(shù)據(jù)庫(kù)重疊的miRNA靶基因作為最終miRNA靶基因；基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNAs進(jìn)行功能分類,將其歸類至相應(yīng)的生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分中；從GO注釋中追蹤KEGG信號(hào)通路的信息,繼續(xù)富集這些表達(dá)差異顯著的miRNAs至對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路。成果：1.PMOP組樣本與SHAM組對(duì)照樣本之間差異表達(dá)的miRNA共829種,在PMOP組呈表達(dá)上調(diào)的有383種,其中17種顯著上調(diào),差異比值最大的miRNA為rno-miR-206-3p(比值4.5)；呈表達(dá)下調(diào)的有446種,其中37種顯著下調(diào),差異比值最低的mi RNA為rno-miR-152-3p(比值0.2)。2. PMOP+GK組與PMOP組對(duì)照樣本之間差異表達(dá)的miRNA共617種,在PMOP+GK組呈表達(dá)上調(diào)的有192種,其中41種顯著上調(diào),差異比值最大的miRNA為rno-let-7i-5p(比值22.1)；呈表達(dá)下調(diào)的有425種,其中31種顯著下調(diào),差異比值最低的miRN A為rno-miR-206-3p(比值0.02)。3.PMOP+LW組與PMOP組對(duì)照樣本之間差異表達(dá)的miRNA共606種,在PMOP+LW組呈表達(dá)上調(diào)的有102種,其中2種顯著上調(diào),差異比值最大的miRNA為rno-miR-novel-chr6_36168(比值3.6)；呈表達(dá)下調(diào)的有504種,其中47種顯著下調(diào),差異比值最低的miRNA為 rno-miR-novel-chr14_8300比值0.04)。4.PMOP+JG組與PMOP組對(duì)照樣本之間差異表達(dá)的miRNA共619種,在PMOP+JG組呈表達(dá)上調(diào)的有191種,其中64種顯著上調(diào),差異比值最大的miRNA為rno-mi R-144-5p(比值35.9)；呈表達(dá)下調(diào)的有428種,其中34種顯著下調(diào),差異比值最低的miRNA為rno-miR-122-5p(比值0.005)。5.靶基因分析：篩選出三種補(bǔ)腎方共同差異表達(dá)的miRNAs,即三個(gè)補(bǔ)腎方同時(shí)下調(diào)的5個(gè)miRNAs:rno-miR-100-5p, rno-miR-novel-chr14_8432、 rno-miR-novel-chr14_8912、rno-miR-novel-chr14_9053、 rno-mi R-novel-chrl_19071,與SHAM組相比他們?cè)赑MOP組都顯著上調(diào)。五個(gè)miRNAs的靶基因做整合分析,發(fā)現(xiàn)交聯(lián)最多的靶基因有：Panx2、RGD156116l Grinl、Plekhg5、 Elk4、Cx3cll RGD1311447、Tnfrsf2、Socsl Mmp9、Ctxnl、Dixdcl、Dbt、Sgsm2、 Pbx2; rno-miR-100-5p的靶基因有157個(gè),其中篩選出Mtmr3、Acerl、Shank2。6.信號(hào)通路分析：這些靶基因涉及骨代謝的多個(gè)細(xì)胞通路,根據(jù)富集得分,其中與骨代謝密切相關(guān)的三條通路：MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路和破骨細(xì)胞分化通路,對(duì)應(yīng)其詳細(xì)靶基因信息,找到5個(gè)miRNAs中與其密切相關(guān)的靶基因：MAPK信號(hào)通路中的基因E1k4和破骨細(xì)胞分化通路中的基因Socsl。結(jié)論：1、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血漿與正常血漿相比伴有一系列miRNA表達(dá)水平的改變,經(jīng)GO功能分析和Pathway分析,miRNA表達(dá)水平的變化可能是引發(fā)PMOP的重要通路。2、補(bǔ)腎方可能通過(guò)下調(diào)PMOP大鼠血漿中miR-100-5p或四個(gè)新的miRNA (miR-novel-chr14_8432、miR-novel-chr14_8912、rno-miR-novel-chrl4_9053、 rno-miR-novel-chrl_19071)的表達(dá)水平,刺激其調(diào)控MAPK信號(hào)通路中的基因Elk4和破骨細(xì)胞分化通路中的基因Socsl的表達(dá),從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用。
【關(guān)鍵詞】：中醫(yī)中藥 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 微小RNA Illumina測(cè)序 表達(dá)譜
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R259
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-13
• 引言13-15
• 第一部分 文獻(xiàn)研究15-27
• 1.1 中醫(yī)藥與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究進(jìn)展15-17
• 1.1.1 病因病機(jī)研究15-16
• 1.1.2 辯證論治研究16
• 1.1.3 補(bǔ)腎方應(yīng)用研究16-17
• 1.1.4 中醫(yī)藥研究中存在的問(wèn)題17
• 1.2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究進(jìn)展17-19
• 1.2.1 病因病機(jī)研究18
• 1.2.2 現(xiàn)代治療研究18-19
• 1.2.3 研究中存在的問(wèn)題19
• 1.3 miRNA與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展19-26
• 1.3.1 miRNA的產(chǎn)生與作用機(jī)制19-20
• 1.3.2 miRNA的生物學(xué)功能研究20-21
• 1.3.3 miRNA的研究技術(shù)方法21-24
• 1.3.4 miRNA在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究中的應(yīng)用24-26
• 1.3.4.1 miRNA作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的生物標(biāo)志物24-25
• 1.3.4.2 miRNA作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療靶點(diǎn)的可能性25-26
• 1.4 小結(jié)26-27
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究27-49
• 2.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及補(bǔ)腎方干預(yù)后血漿miRNA表達(dá)譜研究27-40
• 2.1.1 材料與方法27-32
• 2.1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 2.1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法28-32
• 2.1.2 結(jié)果32-39
• 2.1.3 討論39-40
• 2.2 差異表達(dá)miRNA生物信息學(xué)分析40-49
• 2.2.1 材料與方法41-42
• 2.2.2 結(jié)果42-47
• 2.2.3 討論47-49
• 結(jié)語(yǔ)49-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 附錄55-57
• 在校期間發(fā)表論文情況57-58
• 致謝58

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1 沈偉;徐e，

本文編號(hào)：961613