發(fā)布時(shí)間：2017-09-22 09:10

  本文關(guān)鍵詞：從Akt-mTOR信號(hào)通路研究黃芪菟箭合劑對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)機(jī)制

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【摘要】：研究背景：糖尿病腎病(Diabetes nephropathy, DN)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,也是糖尿病的主要致死原因。在發(fā)達(dá)國(guó)家糖尿病腎病是終末期腎臟疾病(End-stage renal failure,ESRD)的主要原因。目前我國(guó)DN患者在我國(guó)透析人數(shù)中已占據(jù)第二位,僅次于腎小球腎炎。糖尿病腎病極大的影響了患者的生存質(zhì)量,并帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因而如何防止糖尿病的發(fā)生發(fā)展已成為當(dāng)前急迫而重要的課題。腎小球足細(xì)胞哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)活性的異常升高是糖尿病腎病發(fā)生蛋白尿的關(guān)鍵機(jī)制之一。在哺乳動(dòng)物中,mTOR以雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)和雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTORC2)兩種形式存在。mTORC1功能是主要促進(jìn)合成代謝、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。雷帕霉素特異性抑制mTORC1可以防止糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展,但過(guò)度抑制足細(xì)胞mTOR反而會(huì)造成足細(xì)胞的損傷,因而雷帕霉素可能會(huì)因?yàn)槠涠靖弊饔秒y以應(yīng)用于臨床治療糖尿病腎病。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)中藥菟箭合劑具有減少糖尿病大鼠蛋白尿,減輕糖尿病腎病病理改變的作用,并有抑制腎小球系膜細(xì)胞蛋白激酶B(protein kinase B, PKB,也稱(chēng)為Akt)磷酸化的作用。本研究就是基于以往的科研工作,開(kāi)展中醫(yī)藥對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用的深層次研究。目的：觀(guān)察中藥黃芪菟箭合劑對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的影響,從而探討黃芪菟箭合劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用是否與調(diào)節(jié)這一信號(hào)通路有關(guān),同時(shí)觀(guān)察中藥是否可以減輕雷帕霉素的毒副作用。方法：60只清潔級(jí)SD大鼠,隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只(CON組)與糖尿病組50只。糖尿病組大鼠禁食12小時(shí)候后予2%鏈脲佐菌素(STZ 65mg/Kg,臨用前溶于PH4.2枸櫞酸鹽緩沖液)一次性腹腔注射,CON組大鼠予等體積枸櫞酸緩沖液腹腔注射。72小時(shí)后,尾靜脈取血測(cè)血糖,以血糖至16.7mmol/L,為造模成功。將穩(wěn)定成模的42只糖尿病大鼠按體重隨機(jī)分為四組：糖尿病對(duì)照組(DM組,n=10),雷帕霉素干預(yù)組(RAPA組,n=11)、黃芪菟箭合劑干預(yù)組(CM組,n=10)、雷帕霉素聯(lián)合黃芪菟箭合劑干預(yù)組(RAPA+CM組,n=11)。糖尿病模型成功4周后開(kāi)始干預(yù)治療,RAPA組：按0.5mg/kg/qod腹膜內(nèi)注射雷帕霉素；CM組：按lOg/kg/d灌胃黃芪菟箭合劑；RAPA+CM組：lOg/kg/d灌胃黃芪菟箭合劑并按0.5mg/kg/qod腹膜內(nèi)注射雷帕霉素。干預(yù)治療12周后,置代謝籠留12小時(shí)留取尿標(biāo)本,取血,檢測(cè)不同處理因素對(duì)大鼠血清肌酐、尿素氮及尿白蛋白排泄率(微量白蛋白肌酐比值,ACR)的影響,取大鼠腎皮質(zhì)做常規(guī)病理切片,觀(guān)察各組大鼠的腎臟病理變化；應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)ZO-1、nephrin、fibronectin等相關(guān)蛋白的表達(dá)；應(yīng)用Westrn-blot檢測(cè)磷酸化Akt(Thr308)、磷酸化Pten、磷酸化$6K1的蛋白表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Akt、Pten、S6K1的mRNA表達(dá)。結(jié)果：1黃芪菟箭合劑與雷帕霉素對(duì)糖尿病大鼠一般狀況的影響：治療12周后DM組大鼠血糖顯著高于CON組,CM組血糖較DM組明顯降低,RAPA組、RAPA+CM組血糖水平較DM組大鼠無(wú)明顯差異,RAPA、RAPA+CM組大鼠體重顯著低于DM組,而CM組大鼠體重與DM組無(wú)明顯差異；RAPA組大鼠死亡率顯著高于DM組、CM組和RAPA+CM組,CM組、RAPA+CM組死亡率與DM組無(wú)明顯差異。以上結(jié)果說(shuō)明黃芪菟箭合劑與雷帕霉素都可以有效的降低糖尿病大鼠的尿微量白蛋白排泄率,說(shuō)明黃芪菟箭合劑與雷帕霉素對(duì)糖尿病大鼠微量白蛋白尿的治療有效；雷帕霉素治療組大鼠體重明顯降低,死亡率明顯升高,提示雷帕霉素有明顯的毒副作用；中藥與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用可以減少大鼠死亡率。2黃芪菟箭合劑與雷帕霉素對(duì)糖尿病大鼠腎臟病理、細(xì)胞外基質(zhì)、足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響：DM組大鼠較CON組大鼠腎小球體積增大,RAPA組、CM組、RAPA+CM組腎小球肥大情況較DM組明顯減輕；CON組僅個(gè)別腎小球內(nèi)有少量FN陽(yáng)性染色,DM組大鼠腎小球內(nèi)可見(jiàn)顯著的FN陽(yáng)性染色,其他三組治療組FN陽(yáng)性表達(dá)均顯著低于DM組；DM組大鼠Z0-1、nephrin腎小球陽(yáng)性染顯著低于CON組,其他三組治療組ZO-1、nephrin日性表達(dá)顯著高于DM組；說(shuō)明黃芪菟箭合劑與雷帕霉素均有減輕DN大鼠腎臟病理改變、腎小球細(xì)胞外基質(zhì)沉積,維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的作用。3本研究涉及的相關(guān)蛋白及相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況。DM組Pten蛋白表達(dá)較CON組顯著降低,CM組、RAPA+CM組能顯著提高腎組織Pten的表達(dá),但RAPA組腎組織Pten表達(dá)與DM組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；DM組磷酸化$6K1蛋白表達(dá)、S6K1mRNA表達(dá)顯著高于CON組,RAPA組、CM組.RAPA+CM組中磷酸化$6K1蛋白表達(dá)、S6K1mRNA表達(dá)較DM組顯著降低；DM組磷酸化Akt (Thr308)蛋白含量、AktmRNA表達(dá)較CON組顯著增加,CM組、APA+CM組能顯著降低磷酸化Akt(Thr308)蛋白含量和AktmRNA表達(dá),但RAPA組磷酸化Akt (Thr308)蛋白含量和AktmRNA表達(dá)較DM組無(wú)明顯差異。結(jié)論：雷帕霉素和黃芪菟箭合劑都可以有效地保護(hù)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠足細(xì)胞的完整性、保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)、減少尿微量白蛋白排泄率。雷帕霉素單一的抑制mTORC1的激活造成嚴(yán)重的毒副作用。黃芪菟箭合劑在降低血糖的同時(shí),顯示出全面調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的效應(yīng),同時(shí)能夠減少雷帕霉素的毒性,顯示出其臨床潛在的運(yùn)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病腎病 腎小球足細(xì)胞 雷帕霉素靶蛋白 中藥
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R259
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文縮略詞表(Abbreviationand acronyms)11-12
• 綜述12-17
• 前言17-19
• 材料和方法19-29
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法21-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-40
• 1 一般情況29-30
• 2 生化指標(biāo)比較30-31
• 3 腎臟普通病理觀(guān)察結(jié)果31-33
• 4 腎皮質(zhì)FN、ZO-1、nephrin免疫組化染色情況33-35
• 5 Westernblot檢測(cè)各組大鼠腎磷酸化Akt(Thr308)、磷酸化Pten、磷酸化S6K1蛋白表達(dá)35-36
• 6 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎Akt(308)、Pten、S6K1mRNA表達(dá)36-40
• 討論40-46
• 1 關(guān)于糖尿病大鼠模型的建立40
• 2 足細(xì)胞損傷與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路40-42
• 3 關(guān)于雷帕霉素的作用42-43
• 4 關(guān)于黃芪菟箭合劑的作用43-45
• 5 本研究的不足和展望45-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 致謝53-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷54

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本文編號(hào)：899961