發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 19:28

　　 研究目的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是由免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有髓鞘脫失、髓鞘再生障礙、軸索損傷和神經(jīng)變性等特點(diǎn),以腦和脊髓內(nèi)白質(zhì)病理改變?yōu)橹?導(dǎo)致MS患者嚴(yán)重殘疾,其病理生理機(jī)制復(fù)雜,尚無(wú)特效治療策略。MS經(jīng)典動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型。本研究采用雌性C57BL/6小鼠EAE模型,探究針刺“大椎”(GV14)、雙側(cè)“腎俞”(BL23)、雙側(cè)“足三里”(ST36)穴對(duì)雌性C57BL/6小鼠EAE模型的治療作用,并探討其療效機(jī)制:①腦組織JAK2、p-STAT3的表達(dá)變化。②血清中促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的表達(dá)變化。為深入認(rèn)識(shí)MS的發(fā)病機(jī)制,并為臨床針刺治療MS提供新的思路及理論支持。研究方法將40只雌性C57BL/6小鼠稱(chēng)重編號(hào)后,按隨機(jī)數(shù)字表分成空白對(duì)照組、EAE模型組、激素治療組、針刺治療組4個(gè)組,每組10只。除空白對(duì)照組外,其余各組采用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55,MOG35-55)混合完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)制備的完全抗原聯(lián)合百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)將雌性C57BL/6小鼠誘導(dǎo)成EAE模型。空白對(duì)照組和EAE模型組,免疫后第14天開(kāi)始每天抓取、固定一次,并用0.1ml/10g/d生理鹽水灌胃,至免疫后第28天取材。針刺治療組免疫后第14天開(kāi)始,每天同一時(shí)間(上午9:00)針對(duì)“大椎”、雙側(cè)“腎俞”、雙側(cè)“足三里”穴進(jìn)行針刺治療,每次留針15分鐘,至免疫后第28天取材,共15次。激素治療組免疫后第14天開(kāi)始,每天同一時(shí)間(上午9:00),對(duì)小鼠進(jìn)行激素沖擊療法,每次醋酸潑尼松混懸液(0.6mg/ml,醋酸潑尼松片用生理鹽水配制成要求的濃度)灌胃,0.1ml/10g/d,連續(xù)治療15天。從免疫后第0天開(kāi)始直到免疫后第28天實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材為止,每天在相同的時(shí)間點(diǎn)(下午14:00-16:00)觀察小鼠的行為學(xué)變化(如毛色、行為及飲食),隔天稱(chēng)量記錄小鼠的體質(zhì)量,記錄神經(jīng)功能缺損評(píng)分。免疫后第28天進(jìn)行眼球采血,取腦,進(jìn)行腦組織勞克堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol fast blue,LFB)髓鞘染色觀察脫髓鞘程度,檢測(cè)腦組織中JAK2、p-STAT3免疫組化表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IL-17的含量。研究結(jié)果1.體質(zhì)量及神經(jīng)功能缺損評(píng)分于免疫后第10天,EAE模型組、激素治療組、針刺治療組三組小鼠均先后發(fā)病,逐漸出現(xiàn)精神萎靡,食欲下降,體重減輕,尾部無(wú)力、肢體癱瘓、二便失禁和偶有背部皮膚破潰等,逐漸加重�？瞻讓�(duì)照組無(wú)小鼠發(fā)病,體重持續(xù)增長(zhǎng),活動(dòng)度正常。免疫后第0天,各組小鼠體質(zhì)量和神經(jīng)功能缺損評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);免疫后第14天,與空白對(duì)照組相比,EAE模型組、激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均持續(xù)下降(P0.01),神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著增加(P0.01);免疫后第20天,與EAE模型組相比,激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均較高(P0.01)、神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較低(P0.01);與激素治療組相比,針刺治療組的小鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)、神經(jīng)功能缺損評(píng)分較高(P0.01);免疫后第28天,與EAE模型組相比,激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均較高(P0.01)、神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較低(P0.01,P0.05);兩治療組相比,針刺治療組小鼠的體質(zhì)量較低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),神經(jīng)功能缺損評(píng)分無(wú)顯著差異(P0.05)。2.腦組織LFB髓鞘染色空白對(duì)照組小鼠的腦組織LFB髓鞘染色無(wú)異常表現(xiàn),髓鞘致密,排列整齊。EAE模型組、激素治療組和針刺治療組小鼠的腦組織可見(jiàn)大小不等的片狀髓鞘脫失區(qū),呈空泡樣改變,以側(cè)腦室周?chē)蠲黠@。其中EAE模型組,髓鞘脫失最明顯,并且存在有大量空泡樣變化;激素治療組、針刺治療組較EAE模型組髓鞘脫失較少,空泡化程度改變較輕。3.腦組織免疫組化JAK2、p-STAT3腦組織JAK2、p-STAT3免疫組化陽(yáng)性表達(dá)呈黃色。與空白對(duì)照組相比,EAE模型組、激素治療組和針刺治療組的小鼠腦組織JAK2、p-STAT3的表達(dá)水平有顯著差異(P0.01);與EAE模型組相比,激素治療組和針刺治療組的小鼠腦組織JAK2、p-STAT3的表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);針刺治療組、激素治療組相比,小鼠腦組織中JAK2、p-STAT3的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.血清IL-17與空白對(duì)照組相比,EAE模型組、激素治療組和針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達(dá)水平升高,有顯著差異(P0.01);與EAE模型組相比,激素治療組、針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.05);針刺治療組和激素治療組相比,針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達(dá)水平較高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.針刺、激素均可顯著升高雌性C57BL/6小鼠EAE模型的體質(zhì)量,以及降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分,提示針刺、激素均可改善雌性C57BL/6小鼠EAE模型的臨床癥狀,且兩者作用相當(dāng)。2.EAE模型組、針刺治療組和激素治療組腦組織免疫組化JAK2、p-STAT3表達(dá)升高,提示JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響EAE發(fā)病,針刺、激素可顯著下調(diào)雌性C57BL/6小鼠EAE模型腦組織免疫組化JAK2、p-STAT3表達(dá),提示針刺、激素可調(diào)節(jié)JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善EAE發(fā)病,且兩者作用相當(dāng)。3.針刺,激素可顯著下調(diào)雌性C57BL/6小鼠EAE模型血清IL-17的含量,提示針刺,激素可減輕炎性反應(yīng)程度,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而影響IL-17的分泌有關(guān)。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R245
【部分圖文】：

圖２：環(huán)境因素會(huì)影響免疫系統(tǒng)，從而影響ＭＳ發(fā)病和病情。通過(guò)影響免疫系統(tǒng)功能，導(dǎo)致神經(jīng)??炎癥攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致ＭＳ。ＡＰＣ、抗原呈遞細(xì)胞；Ａｂ、抗體：Ｃ、補(bǔ)充；ＣＭＶ、巨細(xì)胞??病毒；ＥＢＶ、巴爾病毒；ＧＭ－ＣＳＦ，粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子；ｍｙｅｌｉｎ－Ａｇ、髓鞘抗原；ＮＯ，一??氧化氮；ＲＯＳ，活性氧；Ｔｃ、細(xì)胞毒細(xì)胞；ＴＧＦ－Ｐ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－ｐ；?ＴＨ、輔助Ｔ細(xì)胞；ＴＮＦ、腫瘤??壞死因子；Ｔｓ、Ｔ?抑制細(xì)胞。［７４］?Ｏｌｓｓｏｎ?Ｔ，Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ?Ｌ?Ｆ，?Ａｌｆｒｅｄｓｓｏｎ?Ｌ．?Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｇｅｎｅｔｉｃ，??ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ?ａｎｄ?ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ?ｒｉｓｋ?ｆａｃｔｏｒｓ?ｆｏｒ?ｍｕｌｔｉｐｌｅ?ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．?Ｎａｔｕｒｅ?Ｒｅｖｉｅｗｓ?Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，?２０１７，?１３（１）：２５．??３．３．２適應(yīng)性免疫??目前，ＭＳ發(fā)病機(jī)制，主要認(rèn)為其與自身反應(yīng)性初始性ＣＤ４＋Ｔ淋巴細(xì)胞的激活有??關(guān)，是ＭＳ發(fā)病機(jī)理中的初始反應(yīng)和關(guān)鍵。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，初始性ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞識(shí)??別表達(dá)ＨＬＡ?ＩＩ型分子的小膠質(zhì)細(xì)胞、浸入的巨噬細(xì)胞和Ｂ細(xì)胞遞呈的抗原。活化的自??身反應(yīng)性Ｔ淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)的粘附分子，使其能夠結(jié)合內(nèi)皮－腦屏障（ＥＢＢ），??同時(shí)，活化的Ｔ淋巴細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（ＭＭＰ），其允許在ＥＢＢ中產(chǎn)生開(kāi)口，從??Ｔ，

子介導(dǎo)的ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，以此預(yù)防此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活過(guò)度引起其細(xì)??胞增殖、分化、代謝異常和生理功能紊亂，形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)。ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信號(hào)通路，如??圖１、圖２［１Ｑ】。??八?Ｃｙｔｏｋｉｎ？??ｙ?／?Ｃｙｔｏｋｉｒ＞ｅ??Ｒｅｃｅｐｔｏｒ??１?ｆｔ???異—??＾?＾?ｋ?Ｇｅｎｅ??ｃ／）?＾?ｊ?＾?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??３２??

Ｋ－ＳＴＡＴ信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞的分化。ＣＤ４＋Ｔ細(xì)胞根據(jù)它們遇到的細(xì)同。具體而言，ＩＬ－１２通過(guò)激活ＪＡＫ２／ＴＹＫ２和ＳＴＡＴ４誘導(dǎo)Ｔｈｌ細(xì)胞分化，ＴＡＴ６誘導(dǎo)Ｔｈ２細(xì)胞分化，而丨Ｌ－６和丨Ｌ－２３以及ＩＬ－ｌ?Ｐ通過(guò)激活ＪＡＫ１／２和Ｓ化。［１０］?Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ?Ｅ?Ｎ，Ｌｉｕ?Ｙ，?Ｍｃｆａｒｌａｉｉｄ?Ｂ?Ｃ，?ｅｔ?ａｌ．?Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｊａｎｕｓ?Ｋｉｎｄ?Ａｃｔｉｖａｔｏｒ?ｏｆ?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?Ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?Ｍｕｌｔｉｐｌｅ?Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ?ａｎｄ?ｔｈｅ?Ａｎｉｍａｌ?Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ?Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］，?Ｊｏｕｒｎａｌ?ｏｆ?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?＆?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ?ｔ?Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ?Ｓｏｃｉｅｔｙ?ｆｏｒ?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ?＆?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ，?２０１４，?３４（８）：５７７－５８８．??Ｔ在ＭＳ及ＥＡＥ的作用???ＳＴＡＴ??－ＳＴＡＴ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，ＪＡＫ和ＳＴＡＴ蛋白是在ＥＡＥ動(dòng)物模型中。ＳＴＡＴ蛋白敲除小鼠己被用于研究不同ＳＴＡＴ蛋白在ＥＡＥ動(dòng)物模ＪＡＫ－ＳＴＡＴ信號(hào)通路作為炎癥和自身免疫疾病的理想治療靶點(diǎn)備受
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