目的:研究蒙藥朱日很滴丸抗動脈粥樣硬化(AS)的作用及機制。方法:1蒙藥朱日很滴丸發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用的研究。將60只日本大耳白兔適應性喂養(yǎng)一周后,隨機分為6組:溶媒對照組(Control)、模型組(Model)、朱日很滴丸高劑量組(HZRH,1160mg/kg)、朱日很滴丸中劑量(MZRH,367mg/kg)、朱日很滴丸低劑量組(LZRH,116mg/kg)、普羅布考組(Probucol,26mg/kg)。采用高脂飼料喂養(yǎng)結合牛血清白蛋白注射(250 mg/kg)的方法干預日本大耳白兔,建立AS動物模型。第8周造模成功后,在模型組的喂養(yǎng)基礎上,朱日很滴丸組分別灌胃給予各劑量朱日很滴丸,每天一次,連續(xù)4周;普羅布考組灌胃給予普羅布考溶液,每天一次,連續(xù)4周;第12周處死。檢測以下指標:(1)造模期間的第1、2和7、8周測定兔攝食量變化,體質量變化;(2)在造模開始至給藥過程中的第0、4、8、12周測定各組血清中總膽固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三脂(TG)及高密度脂蛋白(HDL)的含量;(3)通過油紅O染色法,觀察主動脈斑塊覆蓋率;(4)通過蘇木素-伊紅(HE)染色觀察血管平滑肌增生及內(nèi)膜病理改變。2蒙藥朱日很滴丸抗氧化應激作用的研究。(1)通過Elisa法測定方法“1”中第12周各組血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活力,丙二醛(MDA)、氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)的含量;(2)以氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)共孵育建立動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷模型,同時給予朱日很滴丸含藥血清進行干預。實驗共分為7組:空白組(Control)、模型組(Model)、空白血清組(VSC)、朱日很滴丸高劑量含藥血清組(HZRHS)、朱日很滴丸中劑量含藥血清組(MZRHS)、朱日很滴丸低劑量含藥血清組(LZRHS)、維生素C對照組(Vit C)。(1)采用MTS法測定細胞存活率,確定ox-LDL損傷HUVEC所用的濃度與時間;(2)采用MTS法測定細胞存活率,考察ZRH含藥血清對HUVEC發(fā)揮保護作用時各劑量組的用量與作用時間;(3)采用MTS法測定細胞存活率,考察ZRH含藥血清各劑量對經(jīng)ox-LDL損傷的HUVEC保護作用;(4)采用流式細胞術分析ZRH含藥血清對經(jīng)ox-LDL損傷的HUVEC凋亡的影響;(5)采用流式細胞術分析ZRH含藥血清對經(jīng)ox-LDL損傷的HUVEC細胞周期的影響;(6)采用Elisa法檢測ZRH含藥血清對經(jīng)ox-LDL損傷的各組HUVEC中HO-1的表達量和SOD的活力。3蒙藥朱日很滴丸抗氧化應激作用與Nrf2信號通路相關性的研究。對方法“2-(2)”中HUVEC做如下檢測:(1)采用實時熒光定量PCR(q PCR)法檢測HUVEC中Nrf2的m RNA水平;(2)采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組HUVEC中Nrf2蛋白的表達量;(3)采用蛋白免疫印跡法檢測HUVEC中細胞質與細胞核中Nrf2蛋白的表達量;(4)采用細胞免疫熒光法檢測各組HUVEC中Nrf2的核轉位情況;(5)加入Nrf2的干擾RNA(si RNA),采用MTS法檢測ZRH含藥血清對HUVEC存活率的影響,進一步探討朱日很滴丸發(fā)揮抗氧化應激作用與Nrf2信號通路的相關性。結果:1蒙藥朱日很滴丸發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用的研究。(1)造模期間兔攝食量與體質量變化:與Control組相比,Model組、ZRH各劑量組、Probucol組的攝食量顯著降低(P0.05),但其體質量無明顯不同(P0.05)。(2)通過全自動生化分析儀檢測0、4、8、12周各組兔血清中TG、CHOL、LDL、HDL的含量:于第8周時,與Control組相比,Model組TG、CHOL、LDL均顯著升高(P0.01),表明兔動脈粥樣硬化模型建立成功。于第12周ZRH組給藥結束后,與Model組相比,ZRH各劑量組血清中TG、LDL、CHOL的含量低于Model組,HDL的含量高于Model組,但差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)通過油紅O染色法觀察主動脈斑塊覆蓋率:與Model組相比,ZRH各劑量組主動脈的斑塊覆蓋率顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(4)通過HE染色觀察血管內(nèi)膜病理改變:與Model組相比,HZRH組細胞排列較整齊,平滑肌增生不太明顯,內(nèi)膜層泡沫細胞較少,病變較輕,MZRH、LZRH組相應病變均有減輕。2蒙藥朱日很滴丸抗氧化應激作用的研究。(1)通過Elisa法檢測AS模型兔血清中MDA、ox-LDL的含量和SOD的活力:與Model組相比,ZRH各劑量組血清中MDA的含量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(HZRH:P0.01,MZRH:P0.01,LZRH:P0.05);ox-LDL的含量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(HZRH:P0.01,MZRH:P0.01,LZRH:P0.05);SOD的活力顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(2)(1)通過MTS法測定HUVEC活力,最終選用200μg/m L的ox-LDL作用于HUVEC 12h作為HUVEC最佳損傷條件。(2)通過MTS法測定HUVEC活力,最終選用20%的各劑量ZRHS孵育HUVEC 24h作為考察ZRHS對HUVEC保護作用的最佳條件。(3)通過MTS法測定HUVEC活力,與Model組相比,ZRH各劑量含藥血清組均能顯著提高細胞存活率(P0.01),且各組間呈劑量依賴性。(4)通過流式細胞術檢測ZRH含藥血清對受損HUVEC凋亡的影響:與Model組相比,ZRH各劑量含藥血清組均能顯著降低細胞凋亡率(HZRHS:P0.01,MZRHS:P0.05,LZRHS:P0.05),且各組間呈劑量依賴性。(5)通過流式細胞術檢測ZRH含藥血清對受損HUVEC周期的影響:與Model組相比,HZRHS組能顯著提高細胞中處于S+G2/M期細胞的比率,能夠促進細胞的增殖(P0.01),MZRHS、LZRHS沒有顯著變化(P0.05)。(6)通過Elisa法檢測各組HUVEC中HO-1的表達量和SOD的活力:與Model組相比,ZRH各劑量含藥血清組均能顯著提高細胞中HO-1表達量、SOD的活力,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01),且各組間呈劑量依賴性。3蒙藥朱日很滴丸抗氧化應激作用與Nrf2信號通路相關性的研究。(1)采用實時熒光定量PCR(q PCR)法檢測各組HUVEC中Nrf2的m RNA水平:與Model組相比,ZRH各劑量含藥血清組中m RNA水平顯著上升(P0.05),呈劑量依賴性。(2)通過蛋白免疫印跡法(western blot)檢測各組HUVEC中Nrf2蛋白的表達量:與Model組相比,ZRH各劑量含藥血清組細胞中Nrf2蛋白含量均顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),呈劑量依賴性。(3)通過蛋白免疫印跡法(western blot)檢測各組HUVEC中細胞質與細胞核中Nrf2蛋白的表達量:與Model組相比,ZRH各劑量含藥血清組細胞質中Nrf2蛋白含量顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(HZRHS:P0.01,MZRHS:P0.01,LZRHS:P0.05),呈劑量依賴性;HUVEC細胞核中Nrf2蛋白含量顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),呈劑量依賴性。(4)通過細胞免疫熒光法檢測各組HUVEC中Nrf2的核轉位情況:與Model組相比,ZRH各劑量含藥血清組細胞核中Nrf2表達量增多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),呈劑量依賴性。(5)加入Nrf2的干擾RNA(si RNA),通過MTS法檢測ZRH含藥血清對HUVEC的保護作用:與Model組相比,si RNA+HZRHS、si RNA+MZRHS、si RNA+LZRHS組未能顯著提高細胞存活率(P0.05),表明朱日很滴丸主要通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用。結論:蒙藥朱日很滴丸可能主要基于Nrf2信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用進而表現(xiàn)出抗動脈粥樣硬化作用。
【學位單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R29
【部分圖文】：

圖 1-1 血清中 TG、CHOL、LDL、HDL 的含量注：*與 Control 組相比,*p＜0.05,**p＜0.01;#與 Model 組相比,##p＜0.05.由表 1-2 和圖 1-1 可知，于第 8 周時，與 Control 組相比，Model 組血清中TG、LDL、CHOL 的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。于第12 周朱日很滴丸組給藥結束后，與 Model 組相比，HZRH、MZRH、LZRH 組血清中 TG、LDL、CHOL 的含量降低，HDL 的含量升高，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Probucol 組血清中 LDL、CHOL 的含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TG 的含量降低，HDL 的含量升高，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3.4 兔主動脈油紅 O 染色及斑塊覆蓋率測定結果A

A:兔主動脈油紅 O 染色 B：兔主動脈斑塊覆蓋率注:*與 Control 組相比,**P＜0.01;#與 Model 組相比,##P＜0.01.圖 1-2 兔主動脈斑塊覆蓋情況由圖 1-2 可知，與 Control 組相比，Model 組的斑塊覆蓋率顯著增加有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與 Model 組相比，HZRH、MZRH、LZRH 主斑塊覆蓋率顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Probucol 組主動脈覆蓋率顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。3.5 兔主動脈的 HE 染色結果（40×）ControlModelProbucol

注:*與 Control 組相比,**P＜0.01;#與 Model 組相比,##P＜0.01.圖 1-2 兔主動脈斑塊覆蓋情況由圖 1-2 可知，與 Control 組相比，Model 組的斑塊覆蓋率顯著增加，差有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與 Model 組相比，HZRH、MZRH、LZRH 主動脈斑塊覆蓋率顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Probucol 組主動脈的斑覆蓋率顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。3.5 兔主動脈的 HE 染色結果（40×）ControlModelProbucol
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本文編號：2865172