白色念珠菌是寄生于70%健康人皮膚、生殖器、腸粘膜的正常菌群的一部分,在一定條件下可能導致皮膚粘膜或全身感染。近年來,隨著廣譜抗生素的廣泛應用以及介入診斷和器官移植治療技術的發(fā)展,白色念珠菌的感染率呈上升趨勢,同時非白色念珠菌菌株不斷增加,目前,對常用的抗真菌藥物耐藥的念珠菌菌株數(shù)量不斷增加,給臨床治療帶來很大困難。念珠菌性間擦疹是發(fā)生在腋窩、乳房下、腹股溝等皮膚部位,以紅斑、糜爛、滲出、膿皰為主要特征,主要由白念珠菌局部感染引起的真菌性皮膚病,近年來發(fā)病率不斷上升。濕潤和浸漬的皮膚褶皺是白色念珠菌生長的有利因素,且念珠菌具有多形性,可在不同條件下進行形態(tài)轉換,并且可以形成生物膜,以此來逃避人免疫細胞的識別及對抗抗真菌藥物的殺傷作用。中醫(yī)學有“濕熱生蟲”的理論,并將念珠菌歸屬于蟲邪范疇,苦寒燥濕法是中醫(yī)學治療感染性疾病的重要方法。隨著念珠菌對現(xiàn)存抗真菌藥物耐藥性的不斷增加,尋找廣譜、高效、低毒的抗念珠菌藥物已成為國內(nèi)外醫(yī)學界的熱門話題。我國的中草藥資源豐富,在預防和治療念珠菌感染方面具有一定的優(yōu)勢。中藥在化學結構和作用機制方面均存在多樣性,值得我們?nèi)ド钊胪诰蛱剿�。深入了解念珠菌的生物學特點、致病特點,了解抗真菌藥物的作用靶點,結合中醫(yī)藥的理論及中藥的性質(zhì),利用現(xiàn)代中藥學及現(xiàn)代的分子生物學手段,開發(fā)研究新的抗念珠菌藥物極具價值。本研究根據(jù)中醫(yī)理論及現(xiàn)代中藥學理論,選擇具有苦寒性質(zhì)的中藥救必應為研究對象,觀察救必應溶液對念珠菌性間擦疹的臨床療效,探討救必應酸抑制白色念珠菌的作用機理,為開發(fā)新的抗念珠菌藥物奠定基礎。目的:觀察救必應溶液對念珠菌性間擦疹的臨床療效,探討救必應酸抑制白色念珠菌的作用機理。方法:本研究主要由四部分組成1.觀察救必應溶液對念珠菌性間擦疹的臨床療效。本研究采取隨機對照原則,選取我科120例符合標準的念珠菌性間擦疹患者隨機分為治療組和對照組各60例,治療組:給予救必應溶液冷濕敷患處,每次20分鐘,每天3次;對照組:氟康唑注射液冷濕敷患處,每次20分鐘,每天3次。1周為1療程,觀察2個療程。觀察治療過程中皮損癥狀積分的變化,比較臨床總有效率和真菌轉陰率。2.采用劃線轉種科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對念珠菌性間擦疹菌株進行鑒定。3.微量液基稀釋法測定救必應酸對四種念珠菌的最低抑菌濃度和白色念珠菌最低抑制生物膜濃度。通過救必應酸干預后對四種念珠菌屬的生長曲線的變化研究救必應酸的抑菌效能。4.通過透射電鏡觀察救必應酸對白色念珠菌細胞結構的影響、碘化丙啶染色法觀察細胞膜通透性的變化、高效液相色普法觀察救必應酸對麥角固醇含量的影響。5.Weston-blot、RT-PCR探索救必應酸對白色念珠菌Ras-cAMP-PKA通路關鍵基因Ras1、Cdc35、Tpk1和RAS1、CDC35、TPK1蛋白表達的影響。結果:1.治療2個療程,治療組總有效率77.8%,對照組治療總有效率88.0%,治療組略低于對照組,但兩組總有效率無明顯差異(P0.05)。與治療前比較,兩組皮損癥狀評分均低于治療前(P0.05),但兩組間皮損癥狀評分比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2個療程后治療組轉陰率77.8%,對照組轉陰率88.0%,兩組真菌轉陰率無顯著差異(P0.05)。兩組均未見明顯的不良反應。2.從門診念珠菌性間擦疹患者中分離和鑒定的104株念珠菌中,白色念珠菌共67株,占總數(shù)的66.4%,非白色念珠菌占總數(shù)的33.6%。3.通過微量液基稀釋法考察救必應酸對4種念珠菌共16株念珠菌的MIC,結果顯示:救必應酸對白色念珠菌4種菌株的MIC范圍為8-32μg/mL;對白色念珠菌菌株CCZYY002 SMIC50為256μg/mL;救必應酸對熱帶念珠菌的4種菌株MIC為32-128μg/mL;救必應酸對光滑念珠菌的MIC為32-128μg/mL;救必應酸對克柔念珠菌的MIC為128-256μg/mL。救必應酸濃度介于8-1024μg/mL時,對四種念珠菌屬生長曲線有不同程度的影響。不同濃度的救必應酸均能平穩(wěn)抑制四種念珠菌的生長。4.透射電鏡下救必應酸可使白色念珠細胞細胞壁變薄,細胞核碎裂,胞質(zhì)分散導致細胞死亡。碘化丙啶染色發(fā)現(xiàn),256μg/mL、512μg/mL救必應酸分別導致9.232±2.6%和23.703±3.2%的PI陽性細胞,與空白對照組比較具有顯著性差異(P0.05)。256μg/mL的救必應酸處理后的白色念珠菌細胞膜中的麥角固醇下降至5.60±1.02μg/mL,與生長對照組比較差異顯著(P0.05)。5.通過q RT-PCR檢測,結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)256μg/mL救必應酸干預后,白念珠菌胞內(nèi)部分氧化還原相關基因Ras1、Cdc35、和Tpk1的轉錄水平也有不同程度的變化,其中Ras1,Cdc35和Tpk1分別下調(diào)了38%和30%和26%。Western blot結果表明,在生物被膜12 h,救必應酸處理后的白色念珠菌菌株RAS1、CDC35、TPK1蛋白表達均下調(diào),與空白組相比,下調(diào)36%和27%和24%。實驗結論:1.救必應溶液冷敷治療念珠菌性間擦疹可有效改善患者臨床癥狀,抑制皮膚念珠菌生長,促進真菌轉陰,無不良反應。2.本機構醫(yī)院中念珠菌性間擦疹感染以白色念珠菌為主,非白色念珠菌占一定比例。3.救必應酸對四種念珠菌的最低抑菌濃度不同,對生長曲線產(chǎn)生一定影響。4.救必應酸可破壞白色念珠細胞結構導致細胞死亡,碘化丙啶染色發(fā)現(xiàn)PI陽性細胞增加。其作用機制可能是影響白色念珠菌細胞膜中的麥角固醇合成導致細胞膜通透性增加,進而導致細胞死亡。5.救必應酸可下調(diào)Ras-cAMP-PKA通路上部分關鍵基因Ras1、Cdc35、Tpk1和RAS1、CDC35、TPK1蛋白表達進而抑制白色念珠菌菌絲及生物膜的形成。
【學位單位】：長春中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R275.9
【部分圖文】：

圖 1 救必應酸對白色念珠菌 CCZYY002、光滑念珠菌 CCZYY005、熱帶念珠菌 CCZYY011和克柔念珠菌 CCZYY015 生長曲線的影響4 討論耐藥菌株的選擇性生長可能是長期使用抗真菌藥物的結果，導致帶菌狀態(tài)的形成，增加耐藥菌株的傳播機會。真菌的耐藥的方式主要包括真菌的內(nèi)在耐藥性、真菌耐藥菌株的自然選擇、真菌敏感菌株的變異。提高藥物使用的針對性、減少抗真菌藥物的接觸對減少真菌耐藥性的產(chǎn)生具有重要意義[136]。近年來，白念珠菌仍然是感染率最高的念珠菌，但是非白念珠菌類感染率逐漸升高。研究發(fā)現(xiàn)臨床上不同念珠菌對抗真菌藥物耐藥的易感性存在差異，不同念珠菌的耐藥機制不同[137]。本研究發(fā)現(xiàn)救必應酸對白色念珠菌 4 種菌株的 MIC 值最低，這與文獻報道相似。不同地區(qū)、人群、以及抗真菌藥物的使用情況不同導致了不同耐藥菌株對抗真菌藥物的敏感性不同。有研究調(diào)查發(fā)現(xiàn) 359 株白念珠菌敏感率為伊曲康唑 89.1%、特比萘芬 7.2%、制霉菌素 96.9%、兩性霉素 B94.4%、氟胞嘧啶 90.0%。說明白色念珠菌對大多數(shù)抗真菌

圖 2a 圖 2b圖 2 透射電鏡觀察救必應酸處理后白色念珠菌生物膜細胞的超微結構.2 救必應酸對白念珠菌生物膜細胞的結構損傷產(chǎn)生影響本實驗發(fā)現(xiàn)，256 μg/mL、512 μg/mL 救必應酸分別導致 9.232±2.6%和 23.703±3.2細胞凋亡，與空白對照組比較具有顯著性差異（P<0.05）。因此救必應酸可顯著增色念珠菌的凋亡，其機制可能與改變細胞膜結構以及影響細胞膜通透性有關，并具定的劑量依賴性。

細胞中顯示低二倍體核型特征。根據(jù)光散射的特點，PI 染色可以區(qū)分凋亡細胞峰和壞細胞峰。當細胞壞死時，大部分細胞腫脹，正光散射高于正常值，對側光散射高于正值。細胞壞死是外部環(huán)境作用下的被動過程。3.3 救必應酸可降低白念珠菌細胞膜麥角固醇含量真菌細胞膜結構的完整性、流動性、細胞通透性、結合酶的功能以及物質(zhì)運輸?shù)饶芘c麥角甾醇密切相關。因此，抑制麥角甾醇的生物合成可破壞真菌的細胞膜結構，而起到抗真菌作用。我們應用高效液相色譜法（HPLC）測定白色念珠菌細胞膜中的角固醇含量。與麥角固醇標準品的液相色譜圖的出峰時間和峰面積相對照，生長對照的麥角固醇含量為 7.32±1.13 μg/mL，256 μg/mL 的救必應酸處理后的白色念珠菌細膜中的麥角固醇下降至 5.60±1.02 μg/mL，與生長對照組比較差異顯著（P<0.05）。μg/mL 的氟康唑處理組作為陽性對照，麥角固醇下降最明顯，下降至 3.64±0.58 μg/m對白色念珠菌細胞膜中的麥角固醇含量抑制效果強于救必應酸。

【參考文獻】

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1 熊延靖;董群;;大蒜素對體外白色念珠菌生物活性影響的研究[J];中國臨床藥理學與治療學;2015年11期

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本文編號：2817591