【摘要】：目的:肺癌是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因,肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中,非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例數(shù)的85%。由于肺癌細(xì)胞生長迅速,早期轉(zhuǎn)移和對(duì)放、化療的抵抗,導(dǎo)致NSCLC的5年生存率仍然約為15%。NSCLC通過激活多種主要的信號(hào)通路導(dǎo)致癌細(xì)胞的存活以及化學(xué)抗性,而細(xì)胞凋亡和自噬是控制細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡的兩種重要的生理活動(dòng),在NSCLC的病理生理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用,自噬與凋亡之間的相互作用影響著細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、死亡細(xì)胞的清除以及臨床治療。近年來,中醫(yī)藥及其有效成分的抗癌研究成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。蘇鐵(Cycas revoluta Thunb)是蘇鐵科蘇鐵屬常綠棕桐狀木本植物,具有觀賞、藥用和食用價(jià)值,其主要成分為黃酮類化合物,氨基酸和糖類等,具有清熱、止血、散瘀的功效。本課題首先對(duì)蘇鐵進(jìn)行生藥學(xué)的鑒定,明確蘇鐵的鑒別方法。同時(shí),對(duì)蘇鐵總黃酮進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究,探討蘇鐵總黃酮抗肺癌的初步作用。為了明確蘇鐵抗肺癌的活性成分及作用機(jī)制,對(duì)蘇鐵的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的分離和鑒定,然后結(jié)合查閱文獻(xiàn)和活性篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,確定蘇鐵雙黃酮為實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象,進(jìn)一步采用體外實(shí)驗(yàn)從凋亡和自噬的角度探討蘇鐵雙黃酮抗肺癌生長及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,明確其主要作用途徑和作用靶點(diǎn)。方法:(1)采用原植物形態(tài)鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別的方法對(duì)蘇鐵葉生藥學(xué)特征進(jìn)行鑒定。(2)選取造模成功的Lewis肺癌荷瘤小鼠84只,隨機(jī)分為模型組、空白對(duì)照組、蘇鐵總黃酮高、中、低劑量組、順鉑給藥組、聯(lián)合用藥組,每組12只。分別給藥干預(yù)14天,于第15天時(shí)摘眼球法取血,常規(guī)法剝?nèi)ewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤組織、肺、脾、胸腺,并分別稱重,計(jì)算抑瘤率;采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)Lewis肺癌荷瘤小鼠血清中白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的含量;采用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)觀察Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織的病理形態(tài)變化;采用免疫組化法和Western blot法檢測(cè)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、bFGF、HIF-lα和NF-κB蛋白的表達(dá)水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、bFGF、HIF-1α 和-κB mRNA 的表達(dá)水平。(3)取蘇鐵葉15kg,粉碎成粗粉后用75%乙醇浸泡1 h,之后回流提取(3Xl00LX1.5h),45℃水浴減壓濃縮得總提物稠膏1.3Kg�？偺嵛锝�(jīng)適量水溶解后,分別用二氯甲烷、正丁醇萃取,得到二氯甲烷萃取物200 g和正丁醇萃取物375 g。然后利用硅膠柱層析、Sephadex LH-20、HPLC等分離手段對(duì)二氯甲烷萃取物進(jìn)行分離純化,并通過核磁波譜、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,并對(duì)分離得到的量相對(duì)較多的黃酮類單體化合物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選。(4)通過查閱文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)篩選確定蘇鐵雙黃酮和A549細(xì)胞為接下來的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)蘇鐵雙黃酮對(duì)正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的毒性作用,用梯度濃度的蘇鐵雙黃酮作用于A549細(xì)胞,以MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的生長抑制情況;采用5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EDU)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步觀察蘇鐵雙黃酮是否能夠抑制A549細(xì)胞增殖;通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蘇鐵雙黃酮對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響,通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蘇鐵雙黃酮對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響;以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞的周期分布狀況、胞內(nèi)的ROS水平以及線粒體膜電位的變化;以Annexin V-FITC/PI雙染法、Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的水平;透射電鏡觀察細(xì)胞中自噬體的形成;吖啶橙染色法檢測(cè)蘇鐵雙黃酮對(duì)自噬溶酶體形成的作用。(5)通過RT-PCR法檢測(cè)蘇鐵雙黃酮對(duì)A549細(xì)胞VEGF、TNF-α、NF-κB、Vimentin、Snail、N-cadherin、PI3K、AKT、Beclinl、Atg5、Atg7和P62mRNA表達(dá)的影響;通過Western blot法分析測(cè)定VEGF、TNF-α、NF-κB、Snail、MMP-9、MMP-13、E-cadherin、HIF-1α、PI3K、AKT、Bax、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-Raptor、p-P70S6K的蛋白表達(dá)水平,自噬重要因子LC3、p62蛋白的表達(dá)情況;通過免疫熒光法分析測(cè)定Angiostatin、E-cadherin、HIF-1α、MMP-9、MMP-13 和 LC-3 的表達(dá)量情況。(6)進(jìn)一步使用激活劑IGF-1和抑制劑LY294002來確定蘇鐵雙黃酮是否抑制PI3K/Akt通路,同時(shí)采用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證蘇鐵雙黃酮和PI3K、Akt和mTOR之間的對(duì)接情況。結(jié)果:(1)確定了蘇鐵葉原植物形態(tài)、性狀、顯微和薄層色譜的主要鑒別特征。(2)蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組、順鉑給藥組和聯(lián)合給藥組的Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量與模型組比較均降低,差異具有顯著意義(p0.01)。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示,與模型組比較,蘇鐵總黃酮高劑量組、中劑量組、低劑量組、順鉑給藥組和聯(lián)合用藥(順鉑+蘇鐵總黃酮中劑量)組的Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清中的白介素-2(IL-2)的表達(dá)水平明顯增加,除了蘇鐵總黃酮中劑量組外,其他各組的白介素-10(IL-10)的表達(dá)水平也明顯增加。免疫組化法、Western blot法和RT-PCR法的檢測(cè)結(jié)果基本一致,與模型組比較,蘇鐵總黃酮各給藥組VEGF、bFGF、HIF-1α、NF-κB mRNA的表達(dá)量和對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)率均降低,差異具有顯著性(p0.05)。(3)通過對(duì)蘇鐵的二氯甲烷萃取部位進(jìn)行分離純化,得到了 18個(gè)單體化合物,根據(jù)核磁波譜和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等,其中,10個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)被明確,分別是:4-羥基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde,1)、香草醛(4-hydro xy-3-methoxybenzaldehyde,2)、、2-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)pr opan-1-one(3)、穗花杉雙黃酮(Amentoflavone,4)、4-(4-(benzo[d][1,3]dio xol-5-yl)tetrahydro-1 H,3H-furo[3,4-c]furan-1-y1)-2-methoxyphenol(5)、4-[(2R,3R,4S,5S)-5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,4-dimethyloxolan-2-yl]-2-methox yphenol(6)、、(4aS,10aR)-6-hydroxy-1,1,4a-trimethyl-7-propan-2-yl-3,4,110,10 a-tetrahydrophenanthrene-2,9-dione(7)、蘇鐵雙黃酮(sotetsuflavone,8)、6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one(9)、柚皮素(5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one,10)。(4)(0～160)μmol/L的蘇鐵雙黃酮對(duì)正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的存活無明顯的影響,其毒性作用較小,當(dāng)蘇鐵雙黃酮的處理濃度達(dá)到200μmol/L時(shí),正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B的死亡率增加,與對(duì)照組(0μmol/L)比較,結(jié)果具有極其顯著性差異(p0.01)。蘇鐵雙黃酮對(duì)A549細(xì)胞有顯著的抗增殖活性,與此同時(shí),細(xì)胞內(nèi)的ROS含量明顯增加,線粒體膜電位下降,Bcl-2/Bax的比例降低,細(xì)胞內(nèi)的cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cytochrome C 和 Bax的表達(dá)上調(diào);Cyclin D1、CDK4、Bcl-2 等水平下調(diào)。發(fā)現(xiàn)蘇鐵雙黃酮能夠有效抑制G0/G1期的周期進(jìn)展,隨后誘發(fā)內(nèi)源性凋亡途徑。(5)蘇鐵雙黃酮能夠抑制A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,此外,還可以抑制A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),反映在E-cadherin的上調(diào),N-cadherin、Vimentin、Snail的下調(diào)。在機(jī)理上,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HIF-1α在蘇鐵雙黃酮抗非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起重要作用,其不僅可以介VEGF的表達(dá),使VEGF下調(diào)、Angiostatin上調(diào),同時(shí),還可以影響MMPs的表達(dá),使MMP-9和MMP-13下調(diào)。更重要的是,HIF-1α的表達(dá)可能是通過PI3K/AKT和TNF-α/NF-KB途徑的抑制來調(diào)節(jié)的。(6)蘇鐵雙黃酮介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR途徑的阻斷通過降低PI3K、Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化水平得到證實(shí)。通過用20ng/mLIGF-1處理,蘇鐵雙黃酮對(duì)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制作用被逆轉(zhuǎn),與此相反,蘇鐵雙黃酮與20μMLY294002聯(lián)合治療非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞組顯著增加了 LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換。(7)蘇鐵雙黃酮可以通過氫鍵以及π-H相互作用與PI3Kp85α結(jié)合,其中的重要?dú)埢℅lu342、Ser429和Lys346;蘇鐵雙黃酮可以通過氫鍵、π-H以及π-π相互作用與Akt1結(jié)合,其中的重要?dú)埢ˋsn53、Thr82、Gln203、Gln79和Trp80;蘇鐵雙黃酮可以通過氫鍵相互作用與mTORc1結(jié)合,其中的重要?dú)埢═rp2023、Glu2014和Met2010。結(jié)論:(1)蘇鐵葉的主要鑒別特征可為蘇鐵葉的生藥鑒定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。(2)蘇鐵總黃酮可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子白介素-2和白介素-10的表達(dá)水平,抑制Lewis肺癌模型小鼠腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移并提高其免疫功能。蘇鐵總黃酮治療肺癌的作用機(jī)制可能為:通過抑制侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)VEGF、bFGF、HIF-1α和NF-κB mRNA的表達(dá),進(jìn)一步抑制其對(duì)應(yīng)的功能蛋白的表達(dá),從而發(fā)揮抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移作用。(3)鑒定出來的10個(gè)化合物中,化合物(4)、(8)和(10)為黃酮類化合物,化合物(1～3)、(5～7)和(9)為首次從該屬植物中分離得到,其中,化合物(4)和(8)為雙黃酮類化合物。(4)蘇鐵雙黃酮可以通過上調(diào)胞內(nèi)ROS水平并使線粒體膜電位崩潰而誘發(fā)G0/G1期的周期阻滯與內(nèi)源性凋亡,最終抑制A549細(xì)胞的生長。(5)蘇鐵雙黃酮可以逆轉(zhuǎn)EMT,從而抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲,這一過程可能與PI3K/AKT和TNF-α/NF-κB通路有關(guān)。(6)蘇鐵雙黃酮誘導(dǎo)的自噬與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR途徑的失活有關(guān)。(7)蘇鐵雙黃酮可以和蛋白PI3Kp85α、Akt1 以及mTORc1產(chǎn)生相互作用,其結(jié)合能力排序?yàn)镻I3Kp85αAkt1mTORc1。
【學(xué)位授予單位】：中央民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R29
【圖文】：

圖１－１．常見黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)及其糖基化位點(diǎn)［２Ｇ］。常見的糖基化位點(diǎn)是Ｃ３和Ｃ７邋（黑色箭逡逑頭）。Ｂ環(huán)在一些植物中也觀察到糖基化（空心箭頭）。Ｃ６和Ｃ８糖基化在植物中最為少見（虛線箭逡逑頭）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ｂａｓｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｃｌａｓｓｅｓ邋ｏｆ邋ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｐｏｉｎｔｓ邋ｏｆ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．逡逑Ｃｏｍｍｏｎ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ邋ｐｏｉｎｔｓ邋ａｒｅ邋Ｃ３邋ａｎｄ邋Ｃ７邋（ｂｌａｃｋ邋ａｒｒｏｗｓ）．邋Ｂ邋ｒｉｎｇ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ邋ｉｓ邋ａｌｓｏ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｉｎ邋ｓｏｍｅ逡逑ｐｌａｎｔｓ邋（ｈｏｌｌｏｗ邋ａｒｒｏｗ）．邋Ｃ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ邋ａｒｅ邋ｌｅａｓｔ邋ｆｏｕｎｄ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋（ａｒｒｏｗ邋ｗｉｔｈ邋ｄｏｔｔｅｄ邋ｌｉｎｅｓ）．邋Ｃ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ逡逑ｍｏｓｔｌｙ邋ｏｃｃｕｒｓ邋ａｔ邋ｔｈｅ邋Ｃ６邋ａｎｄ邋Ｃｓ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ．逡逑二、黃酮類化合物的植物分布逡逑黃酮類化合物的分布較為廣泛，通過Ｐ／５ｅｎｏ／－￡ｘｐ／ｏｒｅ；＂邋（ｈｔｔｐ：／／ｐｈｅｎｏｌ－ｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｅｕ／）進(jìn)逡逑行檢索，在檢索的４００種食物中，共有４９２種不同的黃酮和異黃酮類成分，便可略窺逡逑一二，那么，在植物中，黃酮類化合物的分布就更多。對(duì)黃酮類化合物的植物來源進(jìn)行逡逑整理，，、豆、、，此

科蘇鐵屬植物，其化學(xué)成分主要是雙黃酮類化合物、蘇鐵甙和氨基酸等＾１。近年來研究逡逑者從蘇鐵中分離得到的化合物成分。（見表１－２）。近幾年來研究者從蘇鐵屮分離得到的逡逑化合物的結(jié)構(gòu)式。（見圖１－２）。逡逑表１－２近年來從蘇鐵中分離得到的化合物。逡逑Ｔａｂ．邋１－２邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｃｙｃａｓ邋ｒｅｖｏｌｕｔａ邋ｉｎ邋ｒｅｃｅｎｔ邋ｙｅａｒｓ．逡逑編號(hào)邐化合物名稱邐參考文獻(xiàn)逡逑１邐（－）－黑麥草內(nèi)酯邐［１５５．邐１５６］逡逑２邐（２Ｓ，邋２＂邋Ｓ）－２，３，２＂，３＂－四氫異銀杏雙黃酮邐［１５７］逡逑３邐（２Ｓ）－橘皮素邐［１５８］逡逑４邐（２Ｓ，２＂邋Ｓ）－２，３－二氫－４’，４＂’－ｄｉ－０－甲基穗花杉雙黃酮邐［１５９］逡逑５邐（＋）－（７Ｓ，８Ｒ）－二氫去氫二松柏醇（３’－ｍｅｔｈｙｌｃｅｄｒｕｓｉｎ）邐［１６０］逡逑６邐（２Ｓ，２〃邋Ｓ）－２．３，２＂，３〃邋－四氫－４’－０－甲基穗花杉雙黃酮邐［１５７］逡逑７邐（２Ｓ）－２．３－二氫－４’－０－甲基穗花杉雙黃酮邐［１６１］逡逑８邐（２Ｓ）－２，３－二氫扁柏雙黃酮邐［１６１］逡逑９邐４＿．４＿＂－二－０－甲基穗花杉雙黃酮（異銀杏雙黃酮）邐［１６１］逡逑１０邐４’－０－甲基穗花杉雙黃酮（白果素）邐［１６丨

患者３８７０００和１８３０００名女性患者，男性和女性死亡率分別為５５．７１邋／邋１００，０００和逡逑２２．７０邋／邋１００，０００。通過回顧２００７年至２０１２年［？］的肺癌發(fā)病率和死亡率情況，發(fā)現(xiàn)逡逑農(nóng)村和城市的肺癌發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)（見圖１－３邋ａ－ｅ）＝與２０１１年相比，２０１２逡逑年男性和女性肺癌的發(fā)病率分別為３．８１／邋１００．０００和３．６６／邋１００，０００，而２０１２年的增長逡逑率分別為５．９６％和１１．４６％邋（見圖ｌ－３ａ，邋ｂ）。近年來，城市肺癌發(fā)病率急劇上升，例逡逑如，２０１２年北京共報(bào)告了邋８２２０例新發(fā)肺癌病例，占新發(fā)惡性腫瘤病例的２０．３９％，其逡逑中５０４３例病例為男性，發(fā)病率為７７．９４／１００，０００，女性為３１７７，發(fā)病率為４９．５９／１００，０００，逡逑男女比例為１５９：丨００［｜９９］。隨著發(fā)展中國家人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，肺癌逡逑的發(fā)病率大大增加，肺癌己經(jīng)成為我國惡性腫瘤死亡的必然原因，肺癌患者的發(fā)病率呈逡逑逐漸增加的趨勢(shì)，成為我國的一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。逡逑通過整理文獻(xiàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)

本文編號(hào)：2788539