【摘要】：研究目的本研究旨在深入探討膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠腧穴敏化不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)穴區(qū)局部肥大細(xì)胞(MC)形態(tài)和功能變化的時(shí)空特征,初步闡明穴位敏化中MC的細(xì)胞分子水平的機(jī)制,為針灸臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供客觀的實(shí)驗(yàn)支撐,進(jìn)一步豐富穴位敏化MC相關(guān)的機(jī)制研究,解釋穴位敏化細(xì)胞分子層面的科學(xué)內(nèi)涵。研究方法SD雄性大鼠120只,隨機(jī)分為正常(N)組、生理鹽水(NS)組、模型(KOA)組三組,每組40只。然后每組按照0、7、14、21、28天五個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)隨機(jī)再分為五組,每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)后造模,KOA組采用單碘乙酸鹽(MIA)誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎模型,大鼠麻醉后,清理關(guān)節(jié)附近的鼠毛,將關(guān)節(jié)屈曲到最大限度后向雙側(cè)的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA 3mg/50 L 9%生理鹽水,NS組用同樣的方法于雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入50 L 9%的生理鹽水,N組則不做處理。三組僅飼養(yǎng),均不做任何干預(yù)處理。N組、NS組及KOA組分別在實(shí)驗(yàn)開始的第7天隨機(jī)處死6只動(dòng)物并取動(dòng)物的左側(cè)膝關(guān)節(jié),采用番紅固綠染色對(duì)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行染色,觀察關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài),并對(duì)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行OA評(píng)分。N組、NS組及KOA組分別在實(shí)驗(yàn)開始的第0、7、14、21、28天隨機(jī)處死6只動(dòng)物,分別以右側(cè)鶴頂穴、陽陵泉穴、委中穴為中心取1.5mm×1.5 mm×1.5 mm體積大小的標(biāo)本(包含皮膚及皮下結(jié)締組織),采用甲苯胺藍(lán)染色技術(shù)觀察MC形態(tài)和功能的變化,每張切片手動(dòng)隨機(jī)選取6個(gè)不重復(fù)視野,分析并記錄MC的數(shù)目和脫顆粒變化,計(jì)算脫顆粒率。N組、NS組及KOA組分別在實(shí)驗(yàn)開始的第0、7、14、21、28天隨機(jī)選取2只小鼠灌流取穴區(qū)組織,采用免疫熒光(IF)染色技術(shù)觀察不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)鶴頂穴、陽陵泉穴、委中穴穴區(qū)組織內(nèi)肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(MCT)與5-羥色胺(5-HT)、組織胺(HA)共表達(dá)情況。研究結(jié)果1.番紅固綠染色結(jié)果顯示,N組和NS組的關(guān)節(jié)軟骨表面光滑連續(xù)、無損傷,而KOA組關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)學(xué)出現(xiàn)明顯的改變,關(guān)節(jié)軟骨表面不連續(xù),基質(zhì)損傷或者缺失、斷裂、剝奪,甚則軟骨組織被侵蝕,關(guān)節(jié)表面輪廓發(fā)生典型的病理改變。KOA組關(guān)節(jié)軟骨的OA評(píng)分顯著高于N組、NS組(P0.05)。2.甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示,三穴在N組及NS組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)MC的數(shù)量和脫顆粒率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);KOA組鶴頂穴及陽陵泉穴在相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上MC的數(shù)量和脫顆粒率顯著高于N組和NS組(P0.05);KOA組內(nèi)比較結(jié)果顯示鶴頂穴及陽陵泉穴自第7天至28天MC的數(shù)量及脫顆粒率均高于0天,在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上穴區(qū)MC數(shù)量及脫顆粒率比較有顯著差異(P0.05)。3.IF染色結(jié)果顯示,KOA組鶴頂穴及陽陵泉穴MCT與5-HT、HA存在共表達(dá)現(xiàn)象,而委中穴沒有或者較少出現(xiàn)共表達(dá)情況;N組及NS組未出現(xiàn)上述共表達(dá)現(xiàn)象。結(jié)論1.關(guān)節(jié)腔注射MIA能夠造成關(guān)節(jié)軟骨明顯的病理變化,這種方法能成功誘導(dǎo)出膝骨關(guān)節(jié)炎模型。2.穴位敏化中穴區(qū)MC發(fā)生了典型的募集和脫顆粒變化,其中鶴頂穴和陽陵泉穴在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)穴區(qū)MC有時(shí)空變化的特征;穴位敏化是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程,從某一時(shí)間點(diǎn)開始敏化并持續(xù)一段時(shí)間;穴位敏化有時(shí)空變化的特征。3.穴位敏化中MC脫顆粒釋放的遞質(zhì)有5-HT、HA,這兩種物質(zhì)在敏化的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)有不同的表達(dá),穴位敏化中MC與5-HT,HA變化的機(jī)制可能是5-HT,HA以及MCT的釋放直接影響患病的受影響的穴位處的循環(huán),神經(jīng)和免疫網(wǎng)絡(luò),在穴位敏化中起到觸發(fā)效應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R245;R-332
【圖文】：

膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠腧穴敏化不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的肥大細(xì)胞機(jī)制研究４６分布或方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，用2個(gè)獨(dú)立樣本進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為具有顯著性差異。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨切片的OA定量評(píng)分結(jié)果KOA組較N組和NS組均有明顯的差異，KOA組的OA評(píng)分顯著高于N組和NS組(P<0.05)（見圖1）。圖1：各組OA定量評(píng)分注：與N組相比較，P<0.05；與NS組相比，P<0.05。5.2各組膝關(guān)節(jié)軟骨番紅固綠染色結(jié)果番紅固綠染色結(jié)果顯示N組及NS組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、完整，看不到損傷，而KOA組則出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨表面斷裂，纖維化嚴(yán)重，甚則分層，基質(zhì)缺失，損傷程度大于50%（見圖2）。ABC圖2：關(guān)節(jié)軟骨番紅固綠染色

膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠腧穴敏化不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的肥大細(xì)胞機(jī)制研究５４圖5第14天MC甲苯胺藍(lán)染色6小結(jié)甲苯胺藍(lán)（ToluidineBlueO）是一種常用的人工合成染料，其中的陽離子有染色作用，組織細(xì)胞的酸性物質(zhì)與其中的陽離子結(jié)合而被染色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，MC內(nèi)的HA等異染質(zhì)呈異染性紫紅色。MC與穴位有密切的關(guān)系，MC是穴位重要的組織形態(tài)學(xué)依據(jù)，也是穴位功能的重要載體，目前關(guān)于腧穴敏化的研究大多聚焦于MC上，DingN[17]等發(fā)現(xiàn)隨著疾病程度的加

膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠腧穴敏化不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的肥大細(xì)胞機(jī)制研究６１圖1:MCT與5-HT共表達(dá)情況。注：N組與KOA組IF染色結(jié)果，綠色標(biāo)記的為MCT，紅色標(biāo)記的為5-HT，藍(lán)色標(biāo)記的為細(xì)胞核，紅色箭頭代表MC脫出的類胰蛋白酶，白色箭頭代表MCT與5-HT共表達(dá)情況。

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本文編號(hào)：2771265