【摘要】：目的(1)探索原發(fā)性干燥綜合征(Primary sj?gren syndrome,pSS)pSS與健康人之間腸道菌群的是否存在顯著的差異性。(2)進(jìn)一步探索出pSS氣陰兩虛型腸道菌群結(jié)構(gòu)的具體差異。(3)為本課題組以后進(jìn)一步研究pSS與腸道菌群相關(guān)的臨床基礎(chǔ)性研究提供相應(yīng)的參考。方法收取14例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的女性pSS患者的糞便樣本,其中7例為氣陰兩虛型患者、7例為非氣陰兩虛型患者,另外收取7例年齡為45-55歲健康女性的糞便。逐一提取所收集到的糞便樣品細(xì)菌總DNA,隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,針對(duì)16SrDNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行illumina hiseq 2500高通量測(cè)序,得到三組的腸道菌群生物信息數(shù)據(jù),隨后結(jié)合文獻(xiàn)智庫(kù)信息挖掘進(jìn)行組間OTU分析、結(jié)構(gòu)多樣性分析和顯著性差異分析。結(jié)果(1)OTU均數(shù)比較:健康對(duì)照組(n=7)、氣陰兩虛型pSS(n=7)和非氣陰兩虛型pSS(n=7)三組間OTU的均數(shù)進(jìn)行兩兩比較無顯著性差異(P0.05)。利用OTU Rank曲線、observed species指數(shù)、shannon指數(shù)及coverage指數(shù)等繪制稀釋曲線分析三組樣本的復(fù)雜度,測(cè)序結(jié)果表明:所測(cè)數(shù)據(jù)量較完整,本次測(cè)序幾乎能夠完整反映研究對(duì)象中所有微生物的多樣性信息。(2)三組腸道菌群進(jìn)行多樣性比較,無明顯差異。(3)菌群結(jié)構(gòu)比較:健康對(duì)照組與pSS患者在菌群結(jié)構(gòu)上比較,它們均主要由4個(gè)菌門組成,分別是放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)。這四種主要菌門在這三組之間兩兩交叉比較無顯著性差異(P0.05),但各組間的菌門含量波動(dòng)范圍差異明顯。健康人與非氣陰兩虛型pSS存在顯著差異的菌科是Paraprevotellaceae、疣微菌科(Ruminococcaceae)(P0.05),健康人與非氣陰兩虛型pSS存在顯著差異的菌屬是Alistipes、Butyricimonas和Paraprevotella(P0.05);健康人與氣陰兩虛型pSS存在顯著差異的菌科為Mogibacteriaceae(P0.05),健康人與氣陰兩虛型pSS存在顯著差異的菌屬是Butyricicoccus(P0.05);健康人與pSS存在顯著差異的菌種為Butyricicoccus_pullicaecorum和德氏乳酸桿(Lactobacillus_delbrueckii)(P0.05)。(4)不同證型間pSS腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異分析:氣陰兩虛型pSS患者存在特異性菌門,它們分別是衣原體門(Chlamydiae)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、浮霉菌門(Planctomycetes)和厚壁菌門(Firmicutes),非氣陰兩虛型pSS患者存在的特異菌門為迷蹤菌門(Elusimicrobia),但它們?cè)诮M間比較無顯著性差異(P0.05);氣陰兩虛型和非氣陰兩虛型pSS患者相比Butyricicoccus屬在非氣陰兩虛型患者中顯著增加(P0.05),而Paraprevotellaceae科則在氣陰兩虛型患者中顯著增加(P0.05)。結(jié)論(1)pSS患者與健康人之間的腸道菌群多樣性無明顯差異,但在菌群結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出一些特定細(xì)菌比例的顯著差異。(2)pSS患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的特征表現(xiàn)為:抑制炎癥產(chǎn)生、維持免疫平衡的細(xì)菌下調(diào)為主(疣微菌科、Butyricicoccus屬、Alistipes、Butyricimonas、Paraprevotella)。(3)氣陰兩虛型pSS患者致炎菌群豐度比非氣陰兩虛型pSS患者高(衣原體門和Butyricicoccus),在一定程度上說明了氣陰兩虛證型pSS患者是本病活動(dòng)期的主要證候。
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R259
【圖文】：

TU PCA 分析PCA 分析（Principal Component Analysis），即主成分分析，是一種分析和簡(jiǎn)集的技術(shù)，它經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)集中的對(duì)方差貢獻(xiàn)最大。將 A 組、B 組和 C 組樣本，在 97%序列相似性條件下得到的 OTU 豐度信息進(jìn)行 析（圖 3）。我們可以看到正常組（A）、氣陰兩虛組（B）與非氣陰兩虛組（C明顯分組規(guī)律的痕跡，其中 PC1 解釋率為 23.16%，PC2 解釋率為 10.96%。同時(shí)對(duì)所有 OTU 進(jìn)行 PLS-DA 分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)三組間重疊部分較少（圖 4），即三組 O度信息之間存在一定的差異。

圖 4 基于 OTU 豐度的 PLS-DA 分析(按 Description 分組)（二）樣品 Alpha 多樣性對(duì)三組 α 多樣性（Alpha diversity）指數(shù)進(jìn)行分析，兩兩組間比較，Alpha 多樣性不存在顯著差異（P>0.05）（圖 5），也就是組間物種多樣性不存在差異。但是 observedspecies 指數(shù)、chao 指數(shù)、ace 指數(shù)，shannon 指數(shù)在 A 組均高于 B、C 組，說明了 A 組樣品中的物種相對(duì) B、C 組較豐富。而 shannon 指數(shù)以及 simpson 指數(shù)反映群落的多樣性，相同物種豐富度的情況下，shannon 指數(shù)在 A 組高于 B、C 兩組以及 simpson 指數(shù)在 A 組中低于 B、C 組，同樣說明了 A 組中群落中各物種具有較大的均勻度，間接反映了 A 組群落具有較大的多樣性。以上結(jié)果說明了 pSS 患者較健康對(duì)照組的腸道菌群多樣性發(fā)生了一定的變化。

圖 5 組間 Alpha 多樣性盒形圖注：盒形圖可以顯示 5 個(gè)統(tǒng)計(jì)量（最小值，第一個(gè)四分位數(shù)，中位數(shù)，第三個(gè)中位數(shù)和最大值，及由下到上的 5 條線），異常值以“o”標(biāo)。我們將所得到樣本 OTU 的相對(duì)比例，根據(jù) observed species 指數(shù)、shannon 指數(shù)及coverage 指數(shù)的期望值繪制稀釋曲線，結(jié)果如下（圖 6）。其中，observed species 指數(shù)對(duì)應(yīng)的稀釋曲線達(dá)到平臺(tái)期或者趨于平緩，再次說明本次測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，幾乎反映了樣本中所有微生物的多樣性信息。

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