發(fā)布時(shí)間：2020-07-12 22:11

【摘要】：目的:以MyD88基因敲除小鼠和人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)為模型,闡明苗藥防感香囊(香囊)通過TLR-MyD88-NFκB通路提高呼吸道免疫力的機(jī)理。方法:1.體內(nèi)研究:背景系為C57BL/6J雄性小鼠16只,SPF級,隨機(jī)分為2組,每組8只:空白對照組(control組),香囊組(MFS組);MyD88基因敲除小鼠16只(購自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),雄性,SPF級,隨機(jī)分為2組,每組8只:MyD88基因敲除組(MyD88-KO組),MyD88基因敲除+香囊組(MyD88-KO+MFS組)。香囊干預(yù)組小鼠持續(xù)予以苗藥防感香囊吸入處理30天(8:00am-8:00pm持續(xù)12小時(shí)吸入香囊,6天更換1次),30天后處死小鼠取材,檢測血常規(guī)、肝腎功能等常規(guī)生化指標(biāo);采用hematoxylin-eosin染色觀察各組小鼠肺組織病理形態(tài)變化;采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光技術(shù)、Western Blot方法、qRT-PCR等方法檢測小鼠肺組織TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的表達(dá)。2.體外研究:苗藥防感香囊提取物由苗藥防感香囊課題組前期試驗(yàn)提供,BEAS-2B細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫,CCK8法探索苗藥防感香囊提取物作用于BEAS-2B細(xì)胞的最適濃度及時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分為6組:空白對照組(Control組)、MyD88 siRNA組(MyD88 siRNA,MyD88 SI組)、MyD88 siRNA-陰性對照組(MyD88 siRNA negative control,MyD88 SI-NC組)、香囊刺激組(Sachet組)、MyD88 siRNA+香囊刺激組(MyD88 SI+Sachet組)、MyD88 siRNA-陰性對照+香囊刺激組(MyD88 SI-NC+Sachet組)。Western Blot、qRT-PCR等方法檢測各組BEAS-2B細(xì)胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的表達(dá)。結(jié)果:1.體內(nèi)研究:(1)病理結(jié)果顯示:空白對照組、香囊組、MyD88基因敲除組、MyD88基因敲除+香囊組小鼠肺組織輪廓完整,器官、支氣管、毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰、肺泡壁無明顯滲出。香囊組小鼠部分標(biāo)本肺泡腔內(nèi)可見少量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤,Mikawa肺損傷評分進(jìn)行統(tǒng)計(jì),與空白對照組、香囊組相比,結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)血常規(guī):香囊組小鼠白細(xì)胞水平升高(P0.05)。生化指標(biāo):各組小鼠肝腎功統(tǒng)計(jì)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(3)TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的基因和蛋白表達(dá)情況:免疫組化、RT-PCR、Western Blot檢測結(jié)果提示,與空白對照組相比,香囊組(MFS組)小鼠肺組織上述分子的基因和蛋白表達(dá)水平升高(P0.05);MyD88-KO組、MyD88-KO+MFS組小鼠肺組織上述分子的基因和蛋白表達(dá)水平減低(P0.05);與MyD88-KO組相比,MyD88-KO+MFS組小鼠肺組織的表達(dá)水平稍升高(P0.05)。2.體外研究:(1)苗藥香囊提取物濃度為0.003125g/ml時(shí)不影響B(tài)EAS-2B細(xì)胞的細(xì)胞活力,且TAK1、NFκB p65、IκB、MyD88的mRNA的表達(dá)量最高(P0.05)。(2)與空白對照組相比,MyD88 siRNA組、MyD88 siRNA組+香囊刺激組中BEAS-2B細(xì)胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6基因和蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.05),香囊刺激組、MyD88 siRNA-陰性對照+香囊刺激組中BEAS-2B細(xì)胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6的表達(dá)顯著升高(P0.05);與MyD88 siRNA組相比,MyD88 siRNA組+香囊刺激組中BEAS-2B細(xì)胞MyD88、TAK1、NFκB p65、IκB、IL6基因和蛋白的表達(dá)稍增加(P0.05)。結(jié)論:苗藥防感香囊能夠提高機(jī)體呼吸道免疫力,MyD88可能為香囊調(diào)節(jié)呼吸道免疫力的關(guān)鍵因子,香囊可通過增強(qiáng)MyD88表達(dá),激活TLR-MyD88-NFκB信號通路,并刺激下游細(xì)胞因子的釋放起到免疫調(diào)節(jié)的作用。此外,苗藥防感香囊也可能通過MyD88信號傳導(dǎo)通路以外的其它途徑刺激下游細(xì)胞因子的表達(dá),起到調(diào)節(jié)呼吸道免疫力的作用。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R29
【圖文】：

動(dòng)物來源背景系 C57BL/6J 的普通小鼠及 MyD88 基因敲除（MyD88-KO）小鼠各，雄性，SPF 級， 6-7 周鼠齡，體重 25-35g，購自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中附有 MyD88 的基因檢測報(bào)告（見圖 1-1）。標(biāo)準(zhǔn)飼料購自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)心。

圖 1-2 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線ig. 1-2 Standard curve of gradient dilution for standard substa品梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 1-2）計(jì)算出待測樣品的濃度，樣本濃度。

圖 1-3 小鼠肺組織解剖圖Fig. 1-3 Anatomical map of lung tissue in miceControl 組 MFS 組 MyD88-KO 組 MyD88-KO+MFS 組

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10 周洵;葛正行;畢t

本文編號：2752553