【摘要】：研究目的:基于冠心病炎癥反應(yīng)學(xué)說,觀察益氣養(yǎng)陰、活血化痰方對(duì)M1/M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子、mRNA、蛋白表達(dá)的影響,評(píng)價(jià)益氣養(yǎng)陰、活血化痰方在巨噬細(xì)胞極化調(diào)控中的作用,并探討其治療CHD的作用機(jī)制與p3 8MAPK/NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)性。研究方法:利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞,構(gòu)建體外炎癥模型。將RAW264.7細(xì)胞分為空白組、LPS炎癥模型組以及不同濃度的中藥給藥組。電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)不同給藥濃度的益氣養(yǎng)陰、活血化痰方對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖情況的影響;采用Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的分泌量;采用FCM法檢測(cè)M1/M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86、CD206的表達(dá);采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中M1型促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS及M2型抗炎性因子IL-10、TGF-β、Arg-1的表達(dá)量;采用Real-Time PCR法檢測(cè)M1/M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量。運(yùn)用Western blot法檢測(cè)M1型促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1 β、iNOS蛋白的表達(dá)量以及p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量。研究結(jié)果:(1)電子顯微鏡觀察:與空白組相比,LPS組細(xì)胞形態(tài)改變,外周偽足增多;于LPS組相比,給藥組的細(xì)胞偽足減少,正常形態(tài)細(xì)胞增多。(2)MTT 比色法顯示:給藥濃度為2.0 g-L-1及以下時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響。(3)Griess法顯示:與空白組相比,LPS組NO釋放量明顯上調(diào)(P0.01);與LPS組相比,給藥組NO釋放量均下調(diào)(P0.01)。(4)FCM法顯示:LPS干預(yù)后,CD86表達(dá)明顯上升,CD206變化不明顯,提示LPS以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1亞型極化為主。(5)ELISA顯示:與空白組相比,LPS組M1/M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)均上調(diào)(P0.01);與LPS組相比,給藥組可明顯下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞促炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的表達(dá)(P0.01),對(duì)M2型巨噬細(xì)胞抗炎癥因子IL-10、TGF-β、Arg-1無影響。(6)Real-Time-PCR顯示:與空白組相比,LPS組M1/M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)量均上調(diào)(P0.01);與LPS組相比,不同濃度給藥組均可下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞促炎癥因子mRNA表達(dá)量(P0.01,P0.05),對(duì)M2型抗炎性因子mRNA表達(dá)量無影響。(7)Western blot顯示:與空白組比較,LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01);與LPS組相比,給藥組TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS蛋白的表達(dá)均下調(diào)(P0.01)。與空白組相比,LPS組P-p38、P65、IκB蛋白的表達(dá)明顯升高(P0.01),p38表達(dá)量無明顯變化;與LPS炎癥模型組相比,各濃度給藥組均可下調(diào)P-p38、P65、IκB蛋白的表達(dá)量(P0.01)。研究結(jié)論:(1)益氣養(yǎng)陰、活血化痰方可以抑制巨噬細(xì)胞向M1亞型方向極化,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,能夠有效的減少TNF-α、IL-6、IL-1β等相關(guān)促炎性因子的分泌,具有良好的體外抗炎活性。(2)益氣養(yǎng)陰、活血化痰方治療CHD的作用機(jī)制可能是通過調(diào)控p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路,抑制p38MAPK的磷酸化反應(yīng),阻斷NF-κB從細(xì)胞胞質(zhì)向細(xì)胞胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,從而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄功能而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R259
【圖文】：

不同藥物濃度的益氣養(yǎng)陰、活血化痰方干預(yù)后，Ｍｌ亞型巨噬細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物ＣＤ８６逡逑呈逐漸遞減趨勢(shì)，提示益氣養(yǎng)陰、活血化痰方可以抑制巨噬細(xì)胞向Ｍｌ亞型極化，從而發(fā)逡逑揮抗炎作用。見

圖７逡逑１．３．６邋Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果顯示：逡逑

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本文編號(hào)：2724274