【摘要】：目的建立先天腎虛仔鼠模型,以Cx43為切入點,觀察其骨發(fā)育情況,從先天腎精角度驗證“腎主骨發(fā)育”,初步明確先天腎虛與胎源性骨發(fā)育遲緩相關性及Cx43與腎精相關性;采用左歸丸含藥血清培養(yǎng)原代成骨細胞,闡明Cx43蛋白對先天腎虛影響骨發(fā)育的調(diào)控機制。方法1)理論研究:闡明腎與骨關系以及先天腎虛影響胎源性骨發(fā)育的理論機制。2)體內(nèi)實驗:復制先天腎虛模型仔鼠,雌雄合籠制備30只孕鼠(選用SPF級30只SD雌鼠體重270±20g,15只SD雄鼠體重300±20g,合籠配對),將孕鼠隨機分為對照組、模型組、補腎組,每組10只。采用模擬地震振動、光電刺激復合應激恐嚇整個孕期,至胎鼠出生,復制先天腎虛仔鼠模型。造模過程中,對照組孕鼠正常喂養(yǎng)給予生理鹽水灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;模型組孕鼠模擬地震振動、光電刺激復合應激恐嚇同時給予生理鹽水灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;補腎組模擬地震振動、光電刺激復合應激恐嚇同時給予左歸丸灌胃至仔鼠出生,取仔鼠;仔鼠出生后,為減小后天喂養(yǎng)影響,將每只孕鼠調(diào)整相同仔鼠量喂養(yǎng)至5周。取材膜內(nèi)化骨的顱骨骨縫和軟骨內(nèi)化骨的骨骺生長板兩種骨發(fā)育典型部位,對先天腎虛骨發(fā)育情況,及Cx43、Sox9、PTHrP的分布規(guī)律及表達情況進行相關檢測。檢測仔鼠3周內(nèi)平均身長、5周內(nèi)股骨平均長度、Micro CT檢測股骨皮質(zhì)骨及松質(zhì)骨微結(jié)構參數(shù)、第5周股骨鈣、磷、羥脯氨酸含量研究先天腎虛仔鼠骨發(fā)育的情況;取生后第1周仔鼠顱骨骨縫、第3周股骨生長板及第5周股骨皮質(zhì)骨,石蠟包埋切片,分別采用HE、藩紅固綠、馬森染色,進行形態(tài)學觀察;免疫熒光法、RT-PCR技術及WB技術檢測Cx43、Sox9、PTHrP的分布規(guī)律及表達情況,各組組間進行比較,所得數(shù)據(jù)均用sx?表示,用SPSS 17.0軟件處理,單因素方差分析組間比較,采用t檢驗。P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。3)體外實驗,培養(yǎng)原代成骨細胞,觀察細胞增殖、分化、成熟情況,及Cx43表達和其介導的GJIC功能情況。各組原代成骨細胞取材:雌雄合籠制備孕鼠,分為對照組和模型組;模型組給予模擬地震振動、光電刺激復合應激恐嚇至仔鼠出生,對照組正常喂養(yǎng)至仔鼠出生;取模型組仔鼠出生當天顱蓋骨培養(yǎng)原代成骨細胞,分為模型組細胞和補腎組細胞;對照組仔鼠出生當天顱蓋骨培養(yǎng)原代成骨細胞為對照組細胞。制備左歸丸含藥血清:采用大鼠灌胃左歸丸(1.89/Kg)2次/日,連續(xù)5天,末次給藥1h后,麻醉大鼠提取左歸丸含藥血清,滅菌、備用。原代成骨細胞培養(yǎng):三組均用膠原酶消化法獲得成骨細胞進行原代成骨細胞培養(yǎng),差速貼壁法純化成骨細胞,待細胞鋪滿瓶底傳代培養(yǎng),對照組和模型組用小牛血清培養(yǎng),補腎組給予左歸丸含藥血清培養(yǎng)21D。倒置顯微鏡連續(xù)觀察細胞形態(tài);繪制細胞生長曲線(MTT法)、檢測分化情況(ALP活性)、檢測成熟情況(茜素紅染色法);并分別于第7、14、21天檢測成骨細胞Cx43蛋白及mRNA表達情況,第21天時免疫熒光染色檢測Cx43蛋白表達和劃痕染料標記示蹤法檢測GJIC功能檢測,各組組間對比,所得數(shù)據(jù)均用sx?表示,用SPSS 17.0軟件處理,單因素方差分析組間比較,采用t檢驗。P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1)妊娠期復合恐嚇刺激孕鼠,引起孕鼠腎精虧虛無力滋養(yǎng)胎鼠,導致模型組孕鼠胎產(chǎn)數(shù)減少(P0.01或P0.05),有顯著性差異。2)先天腎虛仔鼠平均身長從出生當天到第3周,發(fā)現(xiàn)第8天開始至21天身長變短(P0.05),有明顯性差異;第1、3、5周股骨長度變短(P0.05),組間有明顯性差異。3)第1周顱骨骨縫形態(tài)學觀察,與對照組比較,模型組顱骨骨縫略增寬,骨縫內(nèi)圓形、卵圓形成骨細胞及其前體細胞數(shù)量減少;頂骨骨板變薄,板障空間減少。4)第3周股骨遠端生長板形態(tài)學觀察,模型組股骨生長板增殖層變薄,軟骨細胞無序排列,細胞稀疏,補腎組生長板各層軟骨細胞與對照組形態(tài)排列上無明顯差異。先天腎虛仔鼠,先天腎精不足,影響膜內(nèi)化骨典型部位股骨生長板發(fā)育遲緩。5)第5周股骨檢測骨礦鹽密度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與骨礦鹽密度水平下降相應,模型組骨Ca、P含量減少,各組有明顯差異(P0.01或P0.05)。股骨干皮質(zhì)骨膠原纖維馬森染色觀察股骨基質(zhì)中Ⅰ型膠原纖維形態(tài),各組在形態(tài)學上無明顯差異。Micro CT掃描檢測通過檢測,模型組皮質(zhì)骨厚度、外徑周長、皮質(zhì)骨面積均下降(P0.01或P0.05);掃描遠端松質(zhì)骨微結(jié)構發(fā)現(xiàn),模型組在骨小梁厚度、數(shù)量、骨體積分數(shù)、骨密度上雖有減少表現(xiàn),但組間比較并無顯著性差異(P0.05)。6)Cx43顱骨骨縫表達結(jié)果石蠟包埋切片后行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白在各組織中均染色為棕色,在顱骨骨縫組織中呈高水平表達,主要集中在骨縫邊緣區(qū)域的成骨細胞及其前體細胞胞漿(成骨細胞、成骨樣細胞),與對照組比較,模型組表達降低(P0.05),有顯著性差異,與模型組比較,補腎組表達升高(P0.05),有顯著性差異;WB檢測顱骨骨縫Cx43蛋白含量:與對照組比較,模型組條帶最細平均灰度值相比較有明顯性差異(P0.01),有顯著性差異;與模型組比較,補腎組的條帶粗細和灰度增粗(P0.05),有明顯性差異;RT-PCR檢測顱骨骨縫Cx43 mRNA含量表達:與對照組比較,模型C x43 mRNA含量顯著性降低(P0.05);與模型組比較,補腎組Cx43 mR NA含量顯著性升高(P0.05);對照組與補腎組比較二者無統(tǒng)計學上差異。7)Cx43股骨表達結(jié)果石蠟包埋切片后行免疫組化檢測:股骨生長板主要在儲備層、其次增殖層表達于軟骨細胞的胞漿內(nèi),各組間無顯著性差異(P0.05);股骨干皮質(zhì)骨表達于骨小梁邊緣成骨細胞及骨基質(zhì)中的骨細胞胞漿上,各組間無顯著性差異(P0.05);WB檢測股骨生長板、股骨皮質(zhì)骨Cx43蛋白含量:股骨生長板各組條帶的粗細和灰度均無明顯差異(P0.05),股骨皮質(zhì)骨,各組條帶的粗細和灰度均無明顯差異(P0.05);RT-PCR檢測股骨生長板、股骨皮質(zhì)骨Cx43 mRNA含量:各組股骨生長板、股骨皮質(zhì)骨Cx43 mRNA含量組間比較:三組股骨干皮質(zhì)骨Cx43 m RNA均有表達。與對照組比較,模型Cx43 mRNA含量降低,但不顯著性降低(P0.05),無統(tǒng)計學意義;與模型組比較,補腎組Cx43 mRNA含量升高但不顯著性(P0.05),無統(tǒng)計學意義。8)Sox9股骨生長板表達結(jié)果WB檢測股骨生長板Sox9蛋白含量:與對照組比較,模型組條帶最細平均灰度值相比較有明顯性差異(P0.05),有顯著性差異;與模型組比較,補腎組的條帶粗細和灰度增粗(P0.05),有明顯性差異;RT-PCR檢測股骨生長板Sox9 mRNA表達:與對照組比較,模型Sox9 mRNA含量顯著性降低(P0.01);與模型組比較,補腎組Sox9 mRNA含量顯著性升高(P0.01);對照組與補腎組比較二者無統(tǒng)計學上差異。9)PTHrP股骨表達結(jié)果WB檢測股骨生長板PTHrP蛋白含量:與對照組比較,模型組條帶最細,平均灰度值相比較有明顯性差異(P0.05),有顯著性差異;與模型組比較,補腎組的條帶粗細和灰度增粗(P0.05),有明顯性差異。WB檢測股骨皮質(zhì)骨PTHrP蛋白含量:與對照組比較,模型組條帶最細平均灰度值相比較有明顯性差異(P0.05),有顯著性差異;與模型組比較,補腎組的條帶粗細和灰度增粗(P0.05),有明顯性差異。RT-PCR檢查股骨生長板PTHrP mRNA表達:與對照組比較,模型組仔鼠股骨生長板PTHrP mRNA含量降低,統(tǒng)計學有顯著性差異(P0.05);與模型組比較,補腎組股骨生長板PTHrP mRNA含量明顯升高,統(tǒng)計學有顯著性差異(P0.05);補腎組與對照組PTHrP mRNA含量無明顯性差異(P0.05)。RT-PCR檢查股骨皮質(zhì)骨PTHrP mRNA表達:與對照組比較,模型組仔鼠股骨干皮質(zhì)骨PTHrPmRNA含量降低,統(tǒng)計學有顯著性差異(P0.05);與模型組比較,補腎組股骨干皮質(zhì)骨PTHrP mRNA含量明顯升高,統(tǒng)計學有顯著性差異P0.05);補腎組與對照組PTHrP mRNA含量無明顯性差異(P0.05)。10)PTHrP顱骨骨縫表達結(jié)果WB檢測顱骨骨縫PTHrP蛋白含量:與對照組比較,模型組條帶最細平均灰度值相比較有明顯性差異(P0.05),有顯著性差異;與模型組比較,補腎組的條帶粗細和灰度增粗(P0.05),有明顯性差異。RT-PCR檢測顱骨骨縫PTHrP mRNA含量表達:與對照組比較,模型組仔鼠顱骨骨縫PTHrP mRNA含量降低,統(tǒng)計學有顯著性差異(P0.05);與模型組比較,補腎組顱骨骨縫PTHrP mRNA含量明顯升高,統(tǒng)計學有顯著性差異(P0.05);補腎組與對照組PTHrP mRNA含量無明顯性差異(P0.05)。11)顱骨骨縫培養(yǎng)原代成骨細胞MMT法檢測成骨細胞增殖和細胞活力,模型組上升趨勢緩慢,但各組間比較無顯著性差異(P0.05)。ALP活性檢測成骨細胞分化情況,與對照組比較,模型組ALP活性顯著性降低(P0.05);與模型組比較,補腎組ALP活性顯著性升高(P0.05),有明顯統(tǒng)計學差異。茜紅素染色評估成骨細胞成熟情況,與對照組比較,模型組鈣化結(jié)節(jié)面積顯著性降低(P0.05);與模型組比較,補腎組鈣化結(jié)節(jié)面積顯著性升高(P0.05),有明顯統(tǒng)計學差異。12)成骨細胞Cx43蛋白結(jié)果Cx43蛋白熒光反應沉積物主要呈線性點片狀沿細胞膜表面排列,模型組Cx43蛋白分布減少(P0.05);Cx43 mRNA表達隨著細胞分化的進行,Cx43表達量逐漸增高,第7天模型組略低于對照組和補腎組,但無統(tǒng)計學意義(P0.05);第14、21天明顯低于另兩組,P0.05。Cx43蛋白表達結(jié)果與mRNA表達相對應,對照組與模型組對比,差異顯著(P0.05)。13)成骨細胞GJIC功能檢測結(jié)果各組細胞GJIC功能正常,各組都有熒光黃染料在細胞間的擴散距離;染料擴散面積熒光定量分析顯示,與對照組比較,模型組染料擴散面積熒光定量降低,有顯著性差異(P0.01);與模型組比較,補腎組明顯增加(P0.05)。結(jié)論本課題從母代腎精虧虛導致子代先天腎虛影響其骨發(fā)育的角度進行了理論闡發(fā),首次提出“先天腎虛與胎源性骨病相關”的學術觀點;改進了“恐傷孕鼠腎精”以復制先天腎虛仔鼠動物模型方法,發(fā)現(xiàn)先天腎虛仔鼠出現(xiàn)骨骼發(fā)育遲緩現(xiàn)象;首次以Cx43為切入點,研究先天腎虛影響仔鼠骨發(fā)育的機制。本實驗立足“恐傷腎”理論,采用妊娠期模擬地震平臺復合光電刺激法導致孕鼠腎精虧虛,無力滋養(yǎng)胎兒,成功復制先天腎虛仔鼠模型,觀察仔鼠整體骨發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)模型仔鼠35天內(nèi),身長及股骨長均遲緩,故先天腎精與胎源性骨發(fā)育遲緩相關;檢測顱骨骨縫發(fā)育,發(fā)現(xiàn)模型組仔鼠顱骨頂骨骨板變薄,顱骨骨縫發(fā)育遲緩,Cx43蛋白及mRNA表達均下降,認為Cx43表達下調(diào)是影響先天腎虛仔鼠顱骨骨縫發(fā)育機制之一;檢測股骨發(fā)育,股骨遠端骨骺生長板增值層變薄,Cx43表達無明顯變化,但是局部PTHrP表達及Sox9表達下調(diào),故先天腎虛仔鼠股骨發(fā)育遲緩與局部PTHrP表達及Sox9表達相關;培養(yǎng)原代成骨細胞,發(fā)現(xiàn)先天腎虛影響成骨細胞分化、成熟,Cx43表達下降,其介導GJIC下降,故Cx43介導GJIC調(diào)控成骨細胞分化成熟是影響顱骨骨縫膜內(nèi)成骨的可能分子機制之一;補腎組為左歸丸能治療妊娠期腎精虧虛,結(jié)果顯示身長發(fā)育增快,故認為左歸丸預防子代兒童期骨發(fā)育遲緩,其部分作用機制是調(diào)節(jié)Cx43介導GJIC阻斷仔鼠骨發(fā)育遲緩。結(jié)論歸納如下:1)妊娠期復合法恐嚇刺激孕鼠,影響先天腎虛仔鼠骨發(fā)育,故先天腎精與胎源性骨發(fā)育遲緩相關。2)Cx43表達下調(diào)是影響先天腎虛仔鼠顱骨骨縫發(fā)育機制之一。3)Cx43介導GJIC調(diào)控成骨細胞分化成熟是影響顱骨骨縫膜內(nèi)成骨的可能分子機制之一。4)腎精與Cx43介導GJIC功能一致,影響膜內(nèi)化骨調(diào)控骨生長發(fā)育,因此,Cx43是腎精的物質(zhì)基礎之一。5)左歸丸能治療妊娠期腎精虧虛,預防其子代兒童期骨發(fā)育遲緩。6)Cx43介導GJIC功能是左歸丸補腎填精的作用機制之一。7)先天腎虛仔鼠股骨發(fā)育遲緩與局部PTHrP表達及Sox9表達相關。
【學位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R277.5;R-332
【圖文】：

股骨生長板HE染色對照組(20)對照組(20)對照組(20)

顱骨骨縫及骨縫板障空間HE染色對照組模型組補腎組

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本文編號：2723299