【摘要】：目的:1.研究慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)模型大鼠體內(nèi)炎性因子的含量變化、巨噬細胞遷移抑制因子(macrophase migration inhibitory factor,MIF)及其受體復合物CD74/CD44、受體介導的信號通路p38MAPK、AKT的mRNA及蛋白相對表達量,探討MIF在COPD大鼠病理生理過程中可能作用機制;2.本實驗通過電針COPD模型大鼠的雙側(cè)“足三里”(ST36)和“肺俞”(BL13)穴,從病理形態(tài)、炎癥介質(zhì)等方面觀察電針的治療效果,電針與MIF及其受體復合物、受體介導的信號通路之間的關(guān)系,探討MIF在電針治療COPD大鼠中的作用機制,從而為針刺治療COPD提供有力依據(jù);3.觀察MIF特異性拮抗劑ISO-1/針刺聯(lián)合ISO-1對COPD大鼠肺組織病理學形態(tài)、肺通氣功能、MIF及其受體復合物、受體介導信號通路的表達的影響,探討ISO-1在針刺治療COPD大鼠中的可能作用。方法:1.分組:70只健康成年SPF級體質(zhì)量250~300g的雄性SD大鼠,采用隨機數(shù)字表法分為7組(N=10),分別為正常組、模型組、模型+電針組、模型+ISO-1+電針組、模型+DMSO+電針組(溶媒對照組)、正常+ISO-1+煙熏組、正常+DMSO+煙熏組(溶媒對照組)。2.干預:采用香煙煙熏聯(lián)合氣管滴注脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的復合方法制備COPD大鼠模型,煙熏1個月后通過測定大鼠肺功能以及觀察大鼠肺組織病理形態(tài)判斷COPD大鼠模型制備成功與否。模型+ISO-1+電針組大鼠在電針前30min腹腔注射MIF特異性拮抗劑ISO-1(120ug/kg),溶媒對照組以等量的1%DMSO溶解液腹腔注射,持續(xù)7天;正常+ISO-1+煙熏組大鼠隔日于每次煙熏前30min腹腔注射ISO-1,溶媒對照組以等量的1%DMSO溶解液腹腔注射,持續(xù)1個月。3.電針:電針組選取大鼠下肢雙側(cè)“足三里”(ST36)穴和“肺俞”(BL13)穴,針灸針刺入大鼠雙側(cè)穴位后,同側(cè)兩針柄分別連接電針治療儀的輸出端,參數(shù)選擇采取4/20 Hz交替頻率,持續(xù)0.5 ms,強度設置為1-3 mA,以引起大鼠下肢微微抖動為宜。每日進行針刺,每次電針時間為30分鐘,持續(xù)7天。4.檢測:ELISA法檢測各組大鼠血清、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和肺組織內(nèi)MIF、TNF-α、IL-1β和IL-8含量;定量PCR和Western blot法檢測各組大鼠肺組織內(nèi)MIF及CD74、CD44、p38MAPK、AKT mRNA以及蛋白相對表達量;免疫組化法觀察各組大鼠肺組織中CD74、CD44的表達及分布。結(jié)果:1.大鼠在煙熏聯(lián)合LPS氣管滴注干預后,與正常組大鼠比較,其肺通氣功能明顯下降,用力肺活量容積(FVC),第0.1秒用力呼氣容積(FEV_(0.1)),第0.3秒用力呼氣容積(FEV_(0.3)),FEV_(0.1)/FVC以及FEV_(0.3)/FVC均顯著降低(P0.01);COPD大鼠肺組織出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,肺泡腔擴大,肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變,符合臨床COPD患者的病理形態(tài)學改變;此外,COPD模型組大鼠血清、BALF和肺組織內(nèi)炎性因子含量顯著升高(P0.01),模型組大鼠肺組織內(nèi)MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表達,以及肺組織中CD74、CD44的免疫陽性表達水平升高(P0.01)。2.電針治療COPD大鼠一周后,與模型組大鼠比較,模型+電針組大鼠肺通氣功能指標均顯著升高(P0.01);模型+電針組大鼠血清內(nèi)MIF和IL-1β含量顯著降低(P0.01),TNF-α和IL-8降低(P0.05),其BALF和肺組織內(nèi)炎性因子含量明顯降低(P0.01);模型+電針組大鼠肺組織內(nèi)MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表達,以及肺組織中CD74、CD44免疫陽性表達水平均有降低(P0.01)。3.電針前給予大鼠腹腔注射MIF拮抗劑ISO-1,與模型+電針組相比,模型+ISO-1+電針組大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8含量降低(P0.01),MIF含量降低(P0.05),肺組織內(nèi)MIF、IL-1β和IL-8含量降低(P0.01),TNF-α表達水平降低(P0.05);肺組織內(nèi)MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表達量顯著降低(P0.01);肺組織CD74、CD44免疫陽性表達分別呈不同程度地降低(P0.01;P0.05),模型+ISO-1+電針組與溶媒對照組間各檢測指標有顯著差異(P0.01)。4.煙熏前給予大鼠ISO-1預處理,與模型組相比,正常+ISO-1+煙熏組大鼠血清、BALF和肺組織內(nèi)炎性因子含量顯著下降(P0.01);大鼠肺組織內(nèi)MIF、CD74、CD44、p38MAPK、AKT的mRNA和蛋白表達,以及肺組織中CD74、CD44免疫陽性表達水平降低(P0.01);正常+ISO-1+煙熏組與溶媒對照組間各檢測指標有顯著差異(P0.01)。結(jié)論:1.香煙煙熏聯(lián)合氣管滴注LPS的復合方法可成功復制COPD模型大鼠,本實驗中制備的COPD模型大鼠符合臨床中COPD主要病理學變化以及肺功能特點。2.MIF在香煙煙霧及LPS的誘導下大量釋放,且能夠通過其受體復合物CD74/CD44激活p38MAPK、AKT信號通路,使下游炎癥介質(zhì)的表達增加,可知MIF參與了COPD的病理生理過程。3.電針治療可以有效抑制MIF的生成,下調(diào)或抑制其受體復合物CD74/CD44及受體后p38MAPK、AKT信號通路,進而抑制炎癥介質(zhì)的表達,改善肺部炎癥及肺功能,提示電針對COPD模型大鼠治療效果顯著,其作用機制可能與抑制MIF及其受體通路等有關(guān)。4.MIF特異性拮抗劑ISO-1預處理能夠有效抑制COPD大鼠肺組織內(nèi)MIF表達,通過其受體復合物阻斷p38MAPK、AKT信號通路,從而下調(diào)下游炎癥因子表達水平,發(fā)揮對COPD大鼠的保護作用;此外,電針聯(lián)合MIF特異性拮抗劑ISO-1治療COPD大鼠具有協(xié)同作用,能夠顯著下調(diào)大鼠體內(nèi)炎癥水平,改善其肺通氣功能,對COPD大鼠治療效果顯著。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R245
【圖文】：

COPD 模型大鼠的雙側(cè)“足三里”和“肺俞”穴能夠抑制 MIF 及其受體復合物CD74/CD44、受體介導的信號通路 p38MAPK、AKT，從而下調(diào)炎性因子的釋放，減緩病理發(fā)展和組織損傷，為針刺治療 COPD 提供有力依據(jù)（圖 1）。

圖 2 大鼠煙熏箱Fig.2 The smoking box方法1 腹腔注射劑量 120ug/kg 參考 Wang F Z 等[34]實驗用量，將 ISO-SO 中（DMSO 稀釋于生理鹽水），稀釋的 DMSO 被用作溶媒對型＋ISO-1＋電針組大鼠在電針前 30min 腹腔注射 MIF 特異性拮媒對照組以等量的 1%DMSO 溶解液腹腔注射，持續(xù) 7 天；正常＋大鼠隔日于每次煙熏前 30min 腹腔注射 ISO-1，溶媒對照組以等 溶解液腹腔注射，持續(xù) 1 個月。方法組大鼠被安置于安靜的環(huán)境中，給予大鼠 10%水合氯醛（0.2mL

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