【摘要】：1研究背景中醫(yī)針灸歷來已久,腧穴是針灸發(fā)揮臨床療效的作用點(diǎn),腧穴的研究一直是針灸研究的熱點(diǎn),其形態(tài)學(xué)研究更是備受關(guān)注。研究學(xué)者提出腧穴具有反應(yīng)疾病和治療疾病兩大功能,腧穴反應(yīng)疾病是指腧穴隨機(jī)體狀態(tài)的改變,其功能和大小也在動(dòng)態(tài)變化,機(jī)體由生理到病理的改變,可使腧穴激活而呈現(xiàn)出高敏感性,但腧穴是否真實(shí)存在,腧穴定位何處,腧穴是否具有確切的療效等一直是針灸科研領(lǐng)域爭論的焦點(diǎn)和核心。肥大細(xì)胞與腧穴密切相關(guān),是腧穴組織形態(tài)學(xué)的重要組成部分,是腧穴效應(yīng)的載體。當(dāng)前對于腧穴敏化的研究主要包括理論研究、腧穴生物物理特性研究、敏化機(jī)制研究,為腧穴敏化的研究奠定了理論基礎(chǔ)、拓展了研究思路;提升了腧穴研究的科學(xué)性與針對性;從敏化發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)層面為腧穴敏化的深入研究指明了方向,但目前腧穴敏化的研究尚缺乏客觀指標(biāo)的支撐,還需要進(jìn)一步的研究和討論。2研究目的本實(shí)驗(yàn)采用軟X射線納米CT技術(shù)結(jié)合透射電鏡,觀察膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠(KOA)陽陵泉穴、非穴在腧穴敏化的不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)穴區(qū)肥大細(xì)胞(MC)超微結(jié)構(gòu)及三維立體結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化,探討腧穴敏化的MC機(jī)制,闡明MC敏化的一般規(guī)律,為腧穴敏化的物質(zhì)基礎(chǔ)提供客觀顯像依據(jù),豐富與完善針灸腧穴理論。3研究方法3.1動(dòng)物、細(xì)胞分組及模型制備方法實(shí)驗(yàn)選取SPF級成年健康雄性SD大鼠共72只,隨機(jī)分為正常組、生理鹽水組和模型組,每組24只。體質(zhì)量(155±5)g。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,正常組相同飼養(yǎng)條件下不做任何處理。參考文獻(xiàn)[1]并改進(jìn),模型組于實(shí)驗(yàn)第Od,將3mg單碘乙酸鹽(MIA)溶于50μL無菌生理鹽水溶液,通過髕下韌帶注射至雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),建立MIA誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性KOA動(dòng)物模型,共24只。生理鹽水組的模型制備分兩天進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)第0天,隨機(jī)抽取18只SD大鼠,將50μL無菌生理鹽水溶液通過髕下韌帶注射至雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi),作為假陽性對照;實(shí)驗(yàn)第1天,取余下6只SD大鼠依上訴方法注射生理鹽水,兩天共24只,為提取微透析液做準(zhǔn)備。大鼠皮膚MC購買于北京科瑞思搏生物科技有限公司,參考文獻(xiàn)[2]并改進(jìn),本實(shí)驗(yàn)組采取將MC接種于鎳網(wǎng)上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),直接使用鎳網(wǎng)冷凍制樣觀察的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。提前備好從各組大鼠陽陵泉穴、非穴處提取的微透析液,將微透析液與完全培養(yǎng)基以一定比例混合,放入培養(yǎng)箱預(yù)熱;選取細(xì)胞量合適的鎳網(wǎng)加入微透析液與完全培養(yǎng)基的混合溶液,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激1小時(shí),根據(jù)微透析液的組別將細(xì)胞分為正常組、生理鹽水組、模型組;取出鎳網(wǎng),迅速放入液氮中低溫冷凍制樣,軟X射線納米CT成像觀察。3.2指標(biāo)檢測透射電鏡觀察不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)、不同穴區(qū)局部MC超微結(jié)構(gòu)改變(囊泡是否發(fā)生融合、是否存在空泡、胞內(nèi)致密顆粒占比);軟X射線納米CT技術(shù)觀察腧穴敏化時(shí)大鼠皮膚MC的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,客觀呈現(xiàn)MC三維立體結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化過程。4研究結(jié)果4.1透射電鏡結(jié)果鏡下觀察模型組陽陵泉穴在14d、21d可見特征性的MC脫顆粒改變:顆粒融合,胞外可見已脫出的顆�；蛘诿摮龅念w粒,胞內(nèi)伴隨顆粒密度降低,出現(xiàn)遺留的空泡。模型組陽陵泉穴穴區(qū)MC致密顆粒占比在第7d時(shí)與正常組及生理鹽水組相比,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),第14d、21d,致密顆粒占比顯著低于正常組及生理鹽水組(P0.01);隨時(shí)間的延長,模型組陽陵泉穴穴區(qū)MC致密顆粒占比呈下降趨勢,不同時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);各組非穴穴區(qū)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn),MC致密顆粒占比無明顯變化(P0.05)。4.2軟X射線納米CT成像結(jié)果根據(jù)細(xì)胞內(nèi)各亞結(jié)構(gòu)所表現(xiàn)出的灰度值即線性吸收系數(shù)的不同,進(jìn)行細(xì)胞器分割。軟X線納米CT成像結(jié)果顯示,可觀察到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核、不同密度的顆粒及空泡、高吸收的脂滴樣結(jié)構(gòu)。模型組陽陵泉穴穴區(qū)局部微透析液刺激過的MC在第14d時(shí)部分顆粒線性吸收系數(shù)變小,灰度值降低,經(jīng)3D渲染后可見有正在脫出的顆粒及部分空泡包裹的顆粒,推斷為顆粒部分脫出或脫顆粒后新物質(zhì)正在生成的過程,顆粒融合后腫脹變大密度降低直徑增大。在第21d時(shí)線性吸收系數(shù)繼續(xù)降低,在斷層掃描片層圖上觀察到呈黑色或接近黑色的泡狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)正常組、生理鹽水組陽陵泉穴穴區(qū)微透析液及正常組、生理鹽水組、模型組非穴穴區(qū)局部微透析液刺激過的MC在第14d及21d,形態(tài)結(jié)構(gòu)均未見明顯改變。5研究結(jié)論(1)MC參與了腧穴敏化過程,機(jī)體由生理到病理的轉(zhuǎn)變使MC發(fā)生脫顆�，F(xiàn)象,致密顆粒占比顯著下降,從微觀水平以客觀成像的方式確認(rèn)了腧穴的敏化特性。(2)特定腧穴敏化可能需要一定的時(shí)間來實(shí)現(xiàn),敏化效應(yīng)持續(xù)存在,并伴隨疾病發(fā)展呈動(dòng)態(tài)變化。(3)特定疾病狀態(tài)下腧穴敏化具有腧穴特異性,腧穴是區(qū)別于非穴部位具有特定功能的特殊部位。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R245;R-332
【圖文】：

圖１各組非穴不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)ＭＣ透射電鏡觀察逡逑注：Ｎ為正常組，ＮＳ為生理鹽水組，Ｍ為模型組。ａ列為２１ｄ的部分放大圖（黑色箭頭表示ａ列中與逡逑２１ｄ邋的相同部位，以供參考和定位），７ｄ、１４ｄ、２ｌｄ邋（Ｘ８２００）邋ｂａｒ＝ｌ邋ｕｍ；邋ａ列（Ｘ１１５００）邋ｂａｒ＝ｌ逡逑Ｕ邋ｉｎ逡逑２．邋１．２各組不同時(shí)間點(diǎn)陽陵泉穴穴區(qū)ＭＣ電鏡成像逡逑正常組、生理鹽水組所有時(shí)間點(diǎn)及模型組第７ｄ陽陵泉穴穴區(qū)ＭＣ，未觀察到脫顆粒逡逑樣改變，顆粒電子密度相對較高。模型組陽陵泉穴在第１４ｄ、２１ｄ穴區(qū)ＭＣ內(nèi)可觀察到顆逡逑粒密度有明顯區(qū)別，根據(jù)密度的大小可人為將顆粒分為高、中、低密度三個(gè)等級。模型逡逑組陽陵泉穴在７ｄ時(shí)偶可見少量的較低密度的顆粒；１４ｄ、２１ｄ顆粒密度差異更加明顯，逡逑低密度顆粒逐漸增多，在２１ｄ中胞內(nèi)可見低密度顆粒成片分布。在ＭＣ周圍可見正在脫逡逑出的顆�；蚣好摮龅念w粒，其形態(tài)結(jié)構(gòu)與胞漿內(nèi)顆粒無明顯區(qū)別。顆粒與顆粒之間或顆逡逑粒與細(xì)胞膜之間膜相互融合，形成顆粒脫出的通道，內(nèi)容物腫脹變大，經(jīng)管道釋放至細(xì)逡逑胞外，同時(shí)胞內(nèi)顆粒密度降低，排列松散呈點(diǎn)狀分布。顆粒釋放后膜結(jié)構(gòu)重新閉合，胞逡逑

同時(shí)胞內(nèi)顆粒密度降低，排列松散呈點(diǎn)狀分布。顆粒釋放后膜結(jié)構(gòu)重新閉合，胞逡逑內(nèi)出現(xiàn)邊緣空隙或空泡樣的結(jié)構(gòu)，邊緣空隙－方面是由不完全脫顆粒形成，另一方面也逡逑可能是完全脫顆粒后新顆粒Ｕ：在生成所致，參見圖２、圖３。逡逑４１逡逑

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本文編號(hào)：2713743