【摘要】：研究背景氣血是人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì),氣血間的相互作用和關(guān)聯(lián)影響著人體機(jī)能活動(dòng)狀態(tài)。氣滯血瘀證和氣虛血瘀證是血瘀證的兩個(gè)重要分型,已有一些研究證明,二者存在病理表現(xiàn)、生物學(xué)基礎(chǔ)上的相同點(diǎn)和不同點(diǎn),二者在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中亦存在相關(guān)性。但是,作為凝血系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié),氣滯血瘀證和氣虛血瘀證對(duì)血小板影響方面的研究還較少。在本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn),運(yùn)用不規(guī)律的睡眠剝奪造模法,存在從3周氣滯血瘀到6周氣虛血瘀的病理轉(zhuǎn)化過程。兩種證型均存在體重減輕、毛色枯黃等癥狀,又在脈搏、舌象、痛覺、心功能、血液流變學(xué)等宏觀表征方面存在差異。氣滯血瘀證與氣虛血瘀證在微觀上的變化和異同何在,作為血瘀的關(guān)鍵環(huán)節(jié),血小板功能和形態(tài)是否有變化,兩證的血小板功能和形態(tài)是否存在差異,血小板是否可以作為“氣血交互于脈”中氣血與脈相互作用的樞紐,以及作為抗凝藥物的常見作用環(huán)節(jié),中醫(yī)藥治療不同類型血瘀證是否可以從血小板方面找到相關(guān)理論的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及物質(zhì)基礎(chǔ),這些問題亟待我們探索和討論。目的及意義本研究的目的是探究氣虛血瘀證與氣滯血瘀證大鼠模型血小板功能的變化與差異,同時(shí)給予益氣活血方和理氣活血方作為藥物反證,并探究理氣活血方與益氣活血方對(duì)兩種血瘀證血小板功能的調(diào)節(jié)治療機(jī)制。本研究的意義在于在微觀上研究氣滯血瘀證與氣虛血瘀證大鼠模型血小板的變化,運(yùn)用理氣活血方與益氣活血方對(duì)不同血瘀證候大鼠模型的血小板功能進(jìn)行調(diào)節(jié),并探究其變化的原因和機(jī)理,從而尋找氣滯血瘀證與氣虛血瘀證血小板功能的差異,為中醫(yī)臨床辨證提供實(shí)驗(yàn)佐證,充實(shí)其理論基礎(chǔ),為973課題“氣血交互于脈”的假說提供一定的實(shí)驗(yàn)佐證。方法1.運(yùn)用自制的水環(huán)境小平臺(tái)盒子,進(jìn)行不規(guī)律不完全的睡眠剝奪的造模方式。每個(gè)盒子內(nèi)放六個(gè)小平臺(tái),五只大鼠,上蓋鐵絲網(wǎng)蓋。實(shí)驗(yàn)時(shí)在盒子內(nèi)注入約3cm高的水,大鼠可以在平臺(tái)上自由活動(dòng),但不能俯臥入睡。保證每周總的剝奪時(shí)間達(dá)到112個(gè)小時(shí),平均每天16個(gè)小時(shí),氣滯血瘀證的造模時(shí)間為3周,氣虛血瘀證的造模時(shí)間為6周,并分別在第2周和第5周給予理氣活血方和益氣活血方對(duì)模型進(jìn)行反證,同時(shí)驗(yàn)證和探討理氣活血方和益氣活血方的藥效及作用機(jī)制。2.宏觀表征評(píng)價(jià):檢測(cè)各組大鼠的體重、脈搏、舌象、痛覺、心功能、血液流變學(xué)等宏觀指標(biāo),驗(yàn)證模型成功及藥效。3.基因組學(xué)檢測(cè):通過microRNA基因組學(xué)評(píng)價(jià)氣滯血瘀證大鼠模型和氣虛血瘀證大鼠模型microRNA的變化,尋找與血小板活化相關(guān)的靶基因以及理氣活血方和益氣活血方可能的作用靶點(diǎn)。4.血小板功能及形態(tài)學(xué)研究:AA、ADP、RISTO三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板聚集,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面膜糖蛋白CD62p和CD63的表達(dá)率,掃描電鏡和透射電鏡觀察血小板的外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu),ELISA酶聯(lián)免疫法檢測(cè)各組大鼠血漿PECAM-1的含量。結(jié)果1.宏觀表征:(1)脈搏:同期正常組大鼠脈象平緩,不大不小,均勻規(guī)律,流利有力。氣滯血瘀模型組大鼠脈搏強(qiáng)度較正常組明顯升高(P0.01),呈現(xiàn)高、陡,不夠流利,含有小的起伏,節(jié)奏較快等特點(diǎn)。理氣活血方能明顯改善氣滯血瘀模型大鼠的脈搏,使脈搏強(qiáng)度明顯降低(P0.01),脈象明顯緩和改變。氣虛血瘀模型組大鼠脈搏強(qiáng)度較正常組明顯降低(P0.01),具有低、平,不夠流利,節(jié)奏較慢等特點(diǎn)。益氣活血方能明顯改善氣虛血瘀模型大鼠的脈搏,使強(qiáng)度明顯升高(P0.01),脈象呈現(xiàn)搏動(dòng)更加有力,節(jié)奏加快等特點(diǎn)。(2)體重:氣滯血瘀模型組大鼠與氣虛血瘀模型組大鼠體重較各自同期正常組均明顯減輕(P0.01)。理氣活血方和益氣活血方對(duì)氣滯血瘀模型和氣滯血瘀模型大鼠體重均無明顯改善。(3)舌象:正常組大鼠舌象為淡紅舌,薄白苔。氣滯血瘀證模型組大鼠舌質(zhì)紅暗,舌面R、G、B值較同期正常組均顯著性降低(P0.01,P0.05),理氣活血方可改善氣滯血瘀模型大鼠舌象,舌面的R值和G值明顯升高(P0.05)。氣虛血瘀證模型組大鼠舌質(zhì)紫暗,舌面R、G、B值較同期正常組均有顯著性降低(P0.01,P0.05),益氣活血方可改善氣虛血瘀模型大鼠舌象,使舌面的R、G、B值均顯著性升高(P0.01,P0.05)。(4)痛覺:氣滯血瘀模型組大鼠的痛覺反應(yīng)時(shí)間較正常組明顯縮短(P0.01),理氣活血方可明顯延長氣滯血瘀模型大鼠的痛覺反應(yīng)時(shí)間(P0.01)。氣虛血瘀模型組大鼠的痛覺反應(yīng)時(shí)間較正常組明顯延長(P0.01),益氣活血方可明顯縮短氣虛血瘀模型大鼠的痛覺反應(yīng)時(shí)間(P0.01)。(5)大鼠心臟超聲心動(dòng)圖:與同期正常組比較,氣滯血瘀模型組大鼠心臟左室舒張期體積明顯降低(P0.05),每搏輸出量明顯降低(P0.05),心輸出量明顯降低(P0.01);理氣活血方對(duì)氣滯血瘀模型大鼠的各項(xiàng)心功能參數(shù)均無明顯改善。與同期正常組比較,氣虛血瘀模型組大鼠心臟左室舒張期直徑明顯降低(P0.05),左室舒張期體積明顯降低(P0.05),每搏輸出量明顯降低(P0.05),心輸出量明顯降低(P0.05);益氣活血方能明顯改善氣虛血瘀模型大鼠的心功能,可使心率明顯升高(P0.05),左室舒張期直徑、舒張期體積、每搏輸出量均有升高趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,心輸出量明顯升高(P0.01)。(6)血液流變學(xué):氣滯血瘀模型組大鼠在低切、中切、高切條件下的血液粘度較正常組明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);理氣活血方可明顯改善氣滯血瘀模型大鼠在低切條件下的血液粘度(P0.05)和中切和高切條件下血液粘度(P0.01)。氣虛血瘀模型組大鼠在低切、中切、高切條件下的血液粘度較正常組明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);益氣活血方能明顯改善氣虛血瘀模型大鼠的全血粘度,使中切條件下的血液粘度明顯降低(P0.05),高切條件下的血液粘度明顯降低(P0.01)。2.microRNA基因組學(xué)研究:(1)氣滯血瘀證模型大鼠與氣虛血瘀證模型大鼠較各自同期正常組均有多條microRNA表達(dá)差異,表明其血小板活化可能是受相關(guān)的基因調(diào)控。(2)2條miRNA在兩個(gè)模型組中均表達(dá)差異:rno-miR-344a-5p和rno-miR-762。其中rno-miR-344a-5p與CD63、P選擇素、Gp1b和GpV的表達(dá)密切相關(guān)。(3)理氣活血方與益氣活血方發(fā)揮治療氣滯血瘀證和氣虛血瘀證藥效的機(jī)制可能與調(diào)控相關(guān)microRNA有關(guān)。3.血小板功能及形態(tài)學(xué)研究:(1)血小板聚集實(shí)驗(yàn):由AA、ADP、RISTO三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的氣滯血瘀模型組大鼠血小板最大聚集率(MAR)和平均聚集率(AAR)均較正常組明顯升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。理氣活血方可明顯降低由AA誘導(dǎo)的氣滯血瘀模型大鼠血小板AAR(P0.05),可明顯降低由ADP誘導(dǎo)的氣滯血瘀模型大鼠血小板MAR和AAR(P0.05,P0.01)可明顯降低由RISTO誘導(dǎo)的氣滯血瘀模型大鼠血小板MAR和AAR(P0.01,P0.05)。在氣虛血瘀證血小板聚集實(shí)驗(yàn)中,與同期正常組比較,由AA誘導(dǎo)的氣虛血瘀模型組大鼠AAR明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),由RISTO誘導(dǎo)的氣虛血瘀模型組大鼠血小板最大聚集率(MAR)和平均聚集率(AAR)明顯升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。益氣活血方可明顯改善氣虛血瘀模型大鼠的血小板聚集情況,可見由AA誘導(dǎo)血小板AAR明顯降低(P0.05),由RISTO誘導(dǎo)的血小板MAR和AAR明顯降低(P0.01,P0.05)。(2)血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的表達(dá):氣滯血瘀模型組大鼠血小板CD63表達(dá)率較正常組明顯升高(P0.01)。理氣活血方可明顯降低氣滯血瘀模型大鼠血小板CD63的表達(dá)率(P0.01)。氣虛血瘀模型組大鼠血小板CD62p和CD63的表達(dá)率明顯升高(P0.01,P0.05)。益氣活血方可明顯降低氣虛血瘀模型大鼠血小板CD62p和CD63的表達(dá)率(P0.01,P0.05)。(3)血小板掃描電鏡觀察:正常組血小板散在,不聚團(tuán),活化較少或較輕。氣滯血瘀模型組大鼠血小板活化較正常組明顯,擴(kuò)張型血小板增多,偽足伸出明顯,細(xì)胞膜表面凹凸不平,血小板有聚團(tuán)現(xiàn)象,存在細(xì)胞間膜融合現(xiàn)象。理氣活血方可明顯抑制氣滯血瘀模型大鼠血小板的活化,可見血小板的聚集現(xiàn)象明顯改善,細(xì)胞膜較為平整圓滑,偽足伸出減少。氣虛血瘀模型組大鼠血小板聚團(tuán)現(xiàn)象較正常組明顯增多,有微血栓形成。益氣活血方可明顯改善氣虛血瘀模型大鼠血小板的聚集現(xiàn)象,使血小板微血栓解聚,血小板細(xì)胞膜平滑完整。(4)血小板透射電鏡觀察:正常組大鼠的血小板細(xì)胞膜邊界清晰,血小板內(nèi)顆粒清晰可見,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。氣滯血瘀模型組大鼠血小板細(xì)胞膜有明顯破損,可見血小板顆粒膜與細(xì)胞膜融合,血小板內(nèi)顆粒破裂明顯,顆粒膜互相融合,細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損,血小板形狀發(fā)生變化,有偽足伸出傾向。理氣活血方可明顯改善氣滯血瘀模型大鼠血小板形態(tài),細(xì)胞膜邊界清晰,對(duì)細(xì)胞內(nèi)的顆粒破壞也有明顯改善。氣虛血瘀模型組大鼠血小板細(xì)胞膜融合明顯,血小板連接成片,存在大量巨大顆粒甚至空泡,顆粒破壞嚴(yán)重,線粒體嵴斷裂,細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破損。益氣活血方可明顯改善氣虛血瘀模型大鼠血小板形態(tài),可見血小板呈類圓形,細(xì)胞膜清晰完整,細(xì)胞內(nèi)顆粒膜清晰完整,線粒體結(jié)構(gòu)完整。(5)血漿PECAM-1含量:氣滯血瘀模型組大鼠血漿PECAM-1含量較同期正常組明顯升高(P0.01);理氣活血方可明顯降低氣滯血瘀模型大鼠血漿PECAM-1的含量(P0.01)。氣虛血瘀模型組大鼠血漿PECAM-1含量較同期正常組明顯升高(P0.01);益氣活血方可明顯降低氣虛血瘀模型大鼠血漿PECAM-1的含量(P0.01)。結(jié)論1.睡眠剝奪誘導(dǎo)的大鼠氣滯血瘀證和氣虛血瘀證證候模型造模成功,模型穩(wěn)定易成,符合中醫(yī)病機(jī)。2.氣滯血瘀證和氣虛血瘀證模型大鼠血小板均活化明顯,聚集率升高,血小板形態(tài)學(xué)改變,血小板間存在膜融合現(xiàn)象,細(xì)胞膜發(fā)生破損,顆粒釋放增多,結(jié)構(gòu)受損。3.氣滯血瘀證模型大鼠的血小板活化與致密顆粒釋放更為相關(guān);氣虛血瘀證的血小板活化特點(diǎn)表現(xiàn)為有微血栓的形成,結(jié)構(gòu)受損更為嚴(yán)重。4.理氣活血方和益氣活血方均可通過抑制血小板活化,保護(hù)血小板結(jié)構(gòu)達(dá)到分別治療氣滯血瘀證和氣虛血瘀證的療效。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)相關(guān)microRNA有一定關(guān)系。
【圖文】：

圖１大鼠超聲心動(dòng)圖逡逑２．７血液流變學(xué)逡逑

圖１－１－１氣滯血瘀模型組與正常組及理氣活血方組脈搏（５Ｔ士ｓ，邋ｎ＝１０）逡逑注：與正常組比較，＊Ｐ＜０．０５，“Ｐ＜０．０１；與模型組比較，＃Ｐ＜０．０５，，邋＃＃Ｐ＜０．０１逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R228;R-332

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本文編號(hào)：2676023