【摘要】：目的研究清腸化濕法介導(dǎo)MSCs,通過IL-6/STAT3通路調(diào)控miR-21的表達治療潰瘍性結(jié)腸炎具體機制,并解析其組方藥物主要活性成分沒食子酸的作用機制,進一步探討清腸化濕法治療潰瘍性結(jié)腸炎的科學(xué)內(nèi)涵。方法體外實驗:分離和培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs,運用倒置生物顯微鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞儀鑒定細胞表面標志物,并誘導(dǎo)其成脂分化,鑒定所提細胞種類。采用CCK8法檢測自提MSCs細胞增殖情況,確定后續(xù)實驗清腸化濕復(fù)方干預(yù)濃度。后續(xù)實驗分為MSCs空白組,LPS誘導(dǎo)MSCs細胞所得的炎癥模型組,運用清腸化濕復(fù)方干預(yù)MSCs炎癥模型所得的中藥組,經(jīng)STAT3抑制劑NSC74859處理MSCs細胞所得的抑制劑組,經(jīng)STAT3抑制劑NSC74859處理MSCs炎癥模型所得的模型+抑制劑組,以及清腸化濕復(fù)方和STAT3抑制劑NSC74859共同處理MSCs炎癥模型所得的中藥+抑制劑組。采用ELISA法檢測各組細胞上清液IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10、TGF-β炎性因子的水平,RT-qPCR法檢測各組細胞miR-21、STAT3 mRNA的水平,Western Blot法檢測各組細胞p-STAT3蛋白的表達情況。采用HPLC法同時測定清腸化濕復(fù)方中鹽酸小檗堿、沒食子酸及黃芩苷,采用CCK8法檢測沒食子酸IC50值,確定高中低中藥組濃度。設(shè)立空白對照組及LPS誘導(dǎo)的MSCs炎癥模型組,采用流式細胞儀檢測各組細胞周期及凋亡情況,細胞劃痕及Transwell實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力,運用ELISA法檢測各組細胞上清液IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10、TGF-β的水平,RT-qPCR法檢測各組細胞miR-21、STAT3 mRNA的水平,Western Blot法檢測各組細胞p-STAT3蛋白的表達情況。體內(nèi)實驗:TNBS法建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,60只大鼠隨機分為空白組,TNBS誘導(dǎo)的模型組,在模型組基礎(chǔ)上經(jīng)尾靜脈輸注1ml 1× 106個/ml第三代MSCs細胞懸液的MSCs組,在MSCs組基礎(chǔ)上給予清腸化濕復(fù)方水煎液13.6g/kg灌胃的復(fù)方組,以及在復(fù)方組基礎(chǔ)上腹腔注射5mg/kg STAT3抑制劑NSC74859的復(fù)方+抑制劑組。觀察結(jié)腸黏膜大體形態(tài)及組織病理學(xué)改變,采用ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-6的水平,RT-qPCR法檢測各組大鼠結(jié)腸組織miR-21、STAT3 mRNA的水平,Western Blot法檢測各組大鼠結(jié)腸組織p-STAT3蛋白的表達情況。結(jié)果體外實驗:經(jīng)鑒定,自提細胞符合MSCs細胞特征。與空白組相比,模型組經(jīng)LPS誘導(dǎo)后促炎細胞因子IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α的水平升高,而炎癥抑制因子IL-10和TGF-β的水平則降低,miR-21、STAT3 mRNA的水平升高,p-STAT3蛋白的表達量升高。與模型組相比,中藥組經(jīng)清腸化濕復(fù)方干預(yù)治療可以降低IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α的水平,提高IL-10和TGF-β的水平,降低miR-21、STAT3 mRNA的水平,且能夠降低p-STAT3蛋白的表達量。成功建立了HPLC同時測定清腸化濕復(fù)方中三種活性成分鹽酸小檗堿、沒食子酸及黃芩苷的系統(tǒng)條件。與空白組相比,模型組可造成MSCs細胞周期S期阻滯,凋亡增加,遷移和侵襲能力減弱。與模型組相比,運用沒食子酸干預(yù)處理的中藥組可緩解MSCs的細胞周期阻滯,減少凋亡,增強其遷移侵襲能力,同時可以降低IL-6、IL-lβ、IL-17、TNF-α的水平,提高IL-10和TGF-β的水平,降低miR-21、STAT3 mRNA的水平,降低p-STAT3蛋白的表達量,且呈劑量依賴效應(yīng)。體內(nèi)實驗:與模型組及MSCs組相比,復(fù)方組對結(jié)腸黏膜大體情況及組織病理學(xué)改變有更好的緩解作用,且能夠更好的降低大鼠血清IL-6的水平,降低結(jié)腸組織miR-21、STAT3 mRNA的水平以及p-STAT3蛋白的表達量。結(jié)論成功構(gòu)建并優(yōu)化了大鼠骨髓MSCs分離和培養(yǎng)體系。證明了清腸化濕法可以緩解MSCs炎癥模型的炎癥反應(yīng),降低促炎細胞因子的水平,提高炎癥抑制因子的釋放,維護其免疫調(diào)節(jié)功能。同時清腸化濕法可以介導(dǎo)MSCs,具體機制可能是通過IL6/STAT3通路調(diào)控miR-21的水平,從而提高治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效。清腸化濕法主要活性成分沒食子酸可以改善MSCs炎癥細胞模型細胞周期阻滯,減少細胞凋亡,增強遷移和侵襲能力,可能介導(dǎo)MSCs通過IL-6/STAT3通路調(diào)控miR-21的水平,為中醫(yī)藥臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

圖１邋ＩＬ６／ＳＴＡＴ３信兮通路逡逑

邐第二部分實驗研究邐逡逑４．２自提骨髓ＭＳＣｓ表面標記物鑒定逡逑經(jīng)流式細胞儀檢測，提取所得的細胞高表達間質(zhì)細胞表面標志物ＣＤ２９邋（７８．４％）、逡逑ＣＤ９０邋（８５．４％）、ＣＤ１０６邋（９５．５％），而不表達造血細胞表面標志物邋ＣＤ３１邋（１．１２％）、ＣＤ３４逡逑（４．４８％）、ＣＤ４５邋（２．６８％），，符合間充質(zhì)干細胞特性。逡逑１Ｋ－］邐ｔｔｃｊ邐１Ｋ邋ｊ邐＿＊邋Ｋ＂￣逡逑Ｉ邐？；．逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R259

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本文編號：2659141