【摘要】：咳嗽變異性哮喘(CVA)是慢性咳嗽的主要病因之一,其發(fā)病率高,病情容易反復(fù),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。CVA與典型支氣管哮喘有相似的病理生理特征,目前指南推薦吸入糖皮質(zhì)激素/β受體激動(dòng)劑(ICS/LABA)作為CVA首選治療。但由于治療周期長,部分患者對(duì)吸入激素存在抵觸心理,治療依從性不佳,導(dǎo)致咳嗽癥狀得不到有效控制。也有研究證實(shí),即使規(guī)范吸入ICS/LABA后癥狀能得到有效控制,但一旦停藥,咳嗽癥狀、肺功能、氣道炎癥可出現(xiàn)再次加重,故停藥或中斷用藥被認(rèn)為是不明智的選擇。因此,CVA的治療在有效緩解癥狀的同時(shí),如何減少吸入用藥的使用,減少停藥導(dǎo)致的咳嗽癥狀、肺功能、氣道炎癥再次加重,是研究更應(yīng)關(guān)注的問題。中醫(yī)診治咳嗽有著悠久的歷史。目前多數(shù)醫(yī)家將其歸于“風(fēng)咳”范疇,采用疏風(fēng)宣肺治法。我們?cè)谂R證中的發(fā)現(xiàn),CVA臨床表現(xiàn)除明顯的“風(fēng)”性特點(diǎn)外,還具有“虛”“寒”的特征,因此,提出在疏風(fēng)宣肺的同時(shí),宜配合溫肺之法,并擬定了溫肺疏風(fēng)方。前期臨床觀察發(fā)現(xiàn),在吸入ICS/LABA的基礎(chǔ)上聯(lián)合溫肺疏風(fēng)方治療,很多CVA患者癥狀可以得到長期改善,咳嗽癥狀復(fù)發(fā)率減少,從而減少了 ICS/LABA的使用。由此,我們認(rèn)為溫肺疏風(fēng)方聯(lián)合ICS/LABA治療CVA的優(yōu)勢可能體現(xiàn)在減少復(fù)發(fā),持續(xù)改善癥狀、肺功能及氣道炎癥反應(yīng)等方面。為證之,本研究將通過一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)評(píng)價(jià)溫肺疏風(fēng)方的臨床療效,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選溫肺疏風(fēng)治療CVA的可能通路,并開展實(shí)驗(yàn)研究,探討溫肺疏風(fēng)方治療CVA的分子作用機(jī)制。目的:1.通過一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn),客觀評(píng)價(jià)溫肺疏風(fēng)方治療CVA的有效性和安全性,明確其在CVA治療中的優(yōu)勢。2.通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,篩選溫肺疏風(fēng)方治療CVA可能的途徑,為開展相關(guān)機(jī)制研究提供理論依據(jù)。3.以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選通路為切入點(diǎn),通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討溫肺疏風(fēng)方治療CVA的作用機(jī)制。方法:1.采用隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì),以廣東省中醫(yī)院呼吸科及甄氏流派門診診斷為CVA的患者為研究對(duì)象,觀察比較試驗(yàn)組(口服溫肺疏風(fēng)方顆粒劑聯(lián)合沙美特羅替卡松粉吸入)與對(duì)照組(口服溫肺疏風(fēng)方顆粒劑安慰劑聯(lián)合沙美特羅替卡松粉吸入)治療后4周、8周、12周、停藥后12周、24周各時(shí)點(diǎn)咳嗽視覺模擬評(píng)分、萊塞斯特咳嗽生活質(zhì)量總評(píng)分,比較兩組治療后12周、停藥后12周、24周肺功能相關(guān)指標(biāo),比較兩組停藥后12周、24周咳嗽癥狀累積復(fù)發(fā)率、復(fù)發(fā)患者重新抗炎治療率,并對(duì)溫肺疏風(fēng)方進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。2.通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢溫肺疏風(fēng)方有效化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),通過Disgenet、OMIM、Drugbank、KEGG數(shù)據(jù)庫查詢哮喘相關(guān)靶點(diǎn),將溫肺疏風(fēng)方作用靶點(diǎn)與哮喘靶點(diǎn)進(jìn)行映射,得出溫肺疏風(fēng)方可能作用于哮喘的靶點(diǎn),將映射靶點(diǎn)利用String平臺(tái)構(gòu)建溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)蛋白蛋-白相互作用評(píng)分進(jìn)行篩選,通過Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?獲得溫肺疏風(fēng)方作用哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)映射所得的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析,獲得溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的可能通路。綜合分析溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路富集結(jié)果,選取與哮喘相關(guān)性大的信號(hào)通路進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。3.采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏加霧化激發(fā)的方式構(gòu)建小鼠哮喘模型,實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組:正常組、模型組、地塞米松組、溫肺疏風(fēng)方組,每組8只。模型組、地塞米松組、溫肺疏風(fēng)方組在實(shí)驗(yàn)第0、6、12天分別給予OVA和氫氧化鋁混合液腹腔注射致敏,正常組給予磷酸鹽緩沖液(PBS)腹腔注射。模型組、地塞米松組、溫肺疏風(fēng)方組在實(shí)驗(yàn)第18-31天給予OVA霧化激發(fā),每次激發(fā)40min。正常組給予PBS霧化激發(fā)40min。溫肺疏風(fēng)方組每次激發(fā)前1h用溫肺疏風(fēng)方顆粒劑按2.55g/kg灌胃;地塞米松組每次激發(fā)前1h用地塞米松注射液按2.5mg/kg腹腔注射;正常組及模型組每次激發(fā)前1h用生理鹽水0.5ml灌胃。觀察霧化激發(fā)時(shí)各組小鼠表現(xiàn),治療結(jié)束后48小時(shí)內(nèi)各組小鼠行有創(chuàng)肺功能檢測氣道阻力;收集小鼠支氣管肺泡灌洗液,離心后上清液用于ELISA檢測,細(xì)胞沉淀重懸后涂片行炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù);采用HE染色方法觀察肺組織病理改變,采用PAS染色觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞增生情況;采用ELISA方法檢測支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;采用Real-time PCR檢測肺組織中TLR4-NF-κ B/MAPK信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)TLR4、NF-κBp65、p38MAPK、Erk1/2、JNK mRNA 表達(dá)水平,采用 Western Blot 檢測TLR4、p-NF-K Bp65、p-p38MAPK、p-Erk1/2、p-JNK 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.臨床試驗(yàn)共納入受試者80例,剔除4例,意圖治療(ITT)分析納入76例,依從方案受試者(PPS)分析納入57例。ITT分析和PPS分析結(jié)果一致,(1)咳嗽視覺模擬評(píng)分分析:兩組治療后4周、8周、12周、停藥后12周、24周咳嗽視覺模擬評(píng)分相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。組內(nèi)治療后各時(shí)點(diǎn)與治療前比較,咳嗽視覺模擬評(píng)分均明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)咳嗽癥狀累積復(fù)發(fā)率分析:兩組停藥后24周、12周咳嗽癥狀累積復(fù)發(fā)率相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。試驗(yàn)組有降低停藥后24周復(fù)發(fā)率的趨勢(試驗(yàn)組:36.0%,對(duì)照組:59.4%)。(3)復(fù)發(fā)患者需重新抗炎治療率分析:兩組停藥后24周、12周咳嗽癥狀復(fù)發(fā)患者需重新抗炎治療率相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(4)肺功能分析:兩組治療后12周、停藥后12周、24周肺功能FVC、FEV1、MEF75、PEF50、PEF25各指標(biāo)相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。試驗(yàn)組治療后各時(shí)點(diǎn)MEF75與治療前相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)生活質(zhì)量分析:兩組治療后4周、8周、12周、停藥后12周、24周萊塞斯特咳嗽生活質(zhì)量總評(píng)分相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。組內(nèi)治療后各時(shí)點(diǎn)與治療前比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)影響試驗(yàn)觀察的合并用藥情況分析:兩組均有合并使用影響試驗(yàn)觀察的藥物,但兩組使用率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(7)安全性評(píng)價(jià):兩組治療后出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常變化的情況無顯著差異(P0.05),兩組可疑以上不良反應(yīng)的發(fā)生率無顯著性差異(P0.05)。2.通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢共得到OB≥30%,DL≥0.18溫肺疏風(fēng)方人源靶點(diǎn)蛋白239個(gè),哮喘相關(guān)的人源基因1413個(gè),映射得到110個(gè)溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的靶點(diǎn)。通過拓?fù)浞治龅玫綔胤问栾L(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)有17個(gè),包括JUN、STAT3、QBHIJ4、TNF、EDN1、MAPK等。通路富集分析得到溫肺疏風(fēng)方作用哮喘的KEGG信號(hào)通路11條,其中富集程度較高的通路包括TNF信號(hào)通路,Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等。綜合分析溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路富集結(jié)果,結(jié)合查閱文獻(xiàn),選取與哮喘相關(guān)性大的炎癥信號(hào)通路TLR4-NF-K B/MAPK 展開研究。3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)氣道阻力:與模型組相比,溫肺疏風(fēng)方組小鼠氣道阻力明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)分類:與模型組相比,溫肺疏風(fēng)方組小鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)肺組織病理:與模型組相比,溫肺疏風(fēng)方組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤減輕,氣道上皮杯狀細(xì)胞增生減少。(4)ELISA炎癥因子檢測:與模型組相比,溫肺疏風(fēng)方組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β炎癥因子的表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)Real-time PCR檢測:與模型組相比,溫肺疏風(fēng)方組小鼠肺組織TLR4、NF-κ Bp65、p38MAPK、Erk1/2、JNK mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05)。(6)Western Blot檢測:與模型組相比,溫肺疏風(fēng)方組小鼠肺組織TLR4、p-NF-κ Bp65、p-p38MAPK、p-Erk1/2、p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.與吸入沙美特羅/替卡松粉相比,本研究未發(fā)現(xiàn)溫肺疏風(fēng)方聯(lián)合吸入沙美特羅/替卡松粉在用藥中及停藥后24周內(nèi)對(duì)CVA患者咳嗽癥狀及生活質(zhì)量改善方面的優(yōu)勢。2.與吸入沙美特羅/替卡松粉相比,溫肺疏風(fēng)方聯(lián)合吸入沙美特羅/替卡松粉有降低咳嗽癥狀復(fù)發(fā)率的趨勢,能降低CVA復(fù)發(fā)患者的重新抗炎治療率。3.與治療前比較,溫肺疏風(fēng)方聯(lián)合吸入沙美特羅/替卡松粉有助于改善CVA患者的小氣道功能(MEF75)。4.溫肺疏風(fēng)方可能通過抑制TLR4-NF-κ B/MAPK信號(hào)通路對(duì)CVA發(fā)揮抗炎作用。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R256.12

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