【摘要】：目的:作為一種蛋白激酶C,PKC在腫瘤生長、脾功能以及腫瘤血管形成等方面發(fā)揮著重要的作用,特別是其中的四個亞型:PKCδ、PKCε和PKCα以及PKCβ,具有調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展的作用。前期臨床和實驗研究證明,益氣健脾抗癌法具有抗癌和改善癥狀的作用,正在進行的實驗研究已經(jīng)初步表明,益氣健脾抗癌法的改善癥狀作用是通過提高脾功能實現(xiàn)的,提高肝、脾、腎組織中與脾虛相關(guān)的PKC表達是其健脾的作用機理之一。為了進一步研究益氣健脾抗癌法對腫瘤的影響,分析本法對腫瘤組織中PKC及四個亞型(PKCδ、PKCε、PKCα、PKCβ)作用,我們進行了本項研究。在本研究課題中,以PKC干預作用為出發(fā)點,對益氣健脾抗癌法在影響大腸癌組織瘤體微血管密度和細胞凋亡等方面所具有的作用進行深入分析,探索益氣健脾抗癌法對大腸癌組織PKC蛋白及其亞型PKCδ、PKCε蛋白表達的作用,研究益氣健脾抗癌法對大腸癌組織VEGF、PKCα、PKCβ蛋白表達的影響。這將為益氣健脾抗癌法的臨床應(yīng)用提供新的實驗室依據(jù),奠定益氣健脾抗癌中藥在大腸癌治療中的地位,使更多大腸癌患者的生活質(zhì)量和抗癌治療效果得到提高。材料與方法:1.實驗動物及瘤株:人腸癌HT-29細胞,購于中科院細胞庫;選取15只雌裸鼠和15只雄裸鼠,體重保持在18g-22g之間,鼠齡為4周--5周左右。2.藥物制備:益氣健脾中藥、抗癌中藥、益氣健脾抗癌中藥提取液的制備:益氣健脾中藥由太子參、茯苓、白術(shù)、甘草、砂仁、木香、陳皮、法半夏組成,抗癌中藥由山慈菇、土茯苓、浙貝母、白花蛇舌草、薏苡仁、莪術(shù)、半枝蓮組成,益氣健脾抗癌中藥主要包含上述兩種中藥,在遼寧省中醫(yī)院門診藥局將這些中藥一次性采購齊全。而后對上述2種中藥分別進行10倍水煎煮2h,8倍水煎煮1h,將獲取的2次煎熬湯進行過濾處置,去除藥渣,將藥液濃度提升至3.3g/ml,存放于10ml的小瓶之中,高壓滅(0.1-0.15KPa)15min,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.人大腸HT-29細胞懸液及瘤鼠制備:選取對數(shù)生長期腫瘤細胞,將細胞濃度調(diào)整為1×107/ml,在裸鼠右腋下方實施碘消毒,選用型號為1ml的注射器在小鼠右腋下接種腫瘤細胞液0.2ml/只鼠,整個操作過程均要求無菌操作,每天觀察腫瘤的生長情況。在成功接種15天之后,先前接種位置形成直徑為0.8cm且質(zhì)地比較硬的腫瘤結(jié)節(jié)則被視為瘤。4.動物分組及給藥:動物分組:將30只裸鼠進行統(tǒng)一編號,而后通過隨機分組的方式將其分成三組,一是模型組,二是益氣健脾組,三是益氣健脾抗癌組。每組8只。給藥:模型組予生理鹽水、益氣健脾組給予益氣健脾中藥;益氣健脾抗癌組采用益氣健脾中藥與抗癌中藥相結(jié)合的治療方式,不間斷服藥2周,在第14天的時候,通過脫頸椎方式將實驗小鼠致死,徹底剝離瘤體之后將其放在冰盒中,通過肉眼對瘤組織進行觀察,而后將腫瘤全層組織進行剖切,多部位采取樣本以防腫瘤組織壞死。5.檢測指標:腫瘤細胞凋亡檢測、腫瘤瘤體微血管密度檢測(mvd)、腫瘤細胞vegf表達測定(pcr、westenblot)。應(yīng)用pcr、westenblot兩種方法測定腫瘤組織總pkc、pkcδ、pkcε、pkcα、pkcβ表達結(jié)果。結(jié)果:1.就腫瘤細胞凋亡率而言,模型組偏低,而益氣健脾組很高,益氣健脾組腫瘤細胞凋亡率最高,三者凋亡率分別為3.8±1.2、13.8±2.6、36.2±6.6。與模型組相比,益氣健脾組和益氣健脾抗癌組皆存在明顯差異即存在統(tǒng)計學意義(p0.01),與益氣健脾組相比,益氣健脾抗癌組的細胞凋亡率更高,兩者差異明顯具有統(tǒng)計學價值(p0.01)。瘤體微血管密度,模型組和益氣健脾組以及益氣健脾抗癌組依次為0.227±0.012、0.218±0.010、0.189±0.011,呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。益氣健脾組雖然下降但無統(tǒng)計學意義,但益氣健脾抗癌組下降顯著,相對于模型組和益氣健脾組而言,差異明顯具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。2.模型組和益氣健脾組以及益氣健脾抗癌組的pkcmrna依次是0.596±0.021、0.540±0.015、0.412±0.040,益氣健脾組和模型組兩者之間存在明顯不同(p0.05),而益氣健脾抗癌組和模型組之間所具有的不同更加顯著(p0.01),并且益氣健脾組和益氣健脾抗癌組兩組間亦存在明顯不同(p0.05);三組pkc蛋白分別為0.665±0.016、0.498±0.018、0.261±0.019,益氣健脾組與模型組對比均有顯著性差異(p0.05),而益氣健脾抗癌組與其他兩個小組之間所具有的不同更為顯著(p0.01)。三組pkcδmrna分別為0.233±0.025、0.261±0.034、0.410±0.030,由此可知,益氣健脾抗癌組與其他兩組間皆存在明顯不同(p0.01)。三組pkcδ蛋白分別為0.301±0.041、0.361±0.044、0.516±0.029,模型組和益氣健脾組之間存在明顯不同(p0.05),而益氣健脾抗癌組與模型組、益氣健脾組之間的差異均更加明顯(p0.01)。三組pkcεmrna分別為0.368±0.044、0.359±0.029、0.224±0.029,益氣健脾抗癌組與其他兩組相比,皆存在明顯不同(p0.01);三組pkcε蛋白分別為0.362±0.021、0.314±0.031、0.215±0.021,益氣健脾組和模型組之間存在明顯不同(p0.01),益氣健脾抗癌組與其他兩組相比皆存在顯著不同(p0.01)。3.三組vegfmrna分別為0.447±0.024、0.405±0.033、0.307±0.026,益氣健脾組和模型組相比存在明顯不同(p0.05),而益氣健脾抗癌組和模型組之間所具有的不同更加顯著(p0.01),并且益氣健脾組和益氣健脾抗癌組兩組間亦存在明顯不同(p0.01);三組vegf蛋白分別為0.325±0.037、0.303±0.022、0.230±0.031,益氣健脾組和模型組相比存在明顯不同(p0.05),而益氣健脾抗癌組和其他兩組之間的差異尤為明顯(p0.01)。三組pkcαmrna分別為0.590±0.017、0.472±0.025、0.392±0.025,益氣健脾組和模型組之間存在明顯不同(p0.01),而益氣健脾抗癌組與模型組、益氣健脾組之間均有顯著性差異(p0.01);三組pkcα蛋白分別為0.566±0.024、0.522±0.021、0.335±0.025,益氣健脾組和模型組之間存在明顯不同(p0.05),而相對而言,益氣健脾抗癌組和其他兩組之間所存在的差異尤為明顯(p0.01)。三組pkcβmrna分別為0.583±0.029、0.471±0.039、0.400±0.024,益氣健脾組和模型組之間存在明顯不同(p0.01),而益氣健脾抗癌組與模型組、益氣健脾組之間均有顯著性差異(p0.01);三組pkcβ蛋白分別為0.542±0.061、0.414±0.081、0.292±0.040,益氣健脾組和模型組之間存在明顯不同(p0.01),而益氣健脾抗癌組其他兩組之間亦存在顯著不同(p0.01)。結(jié)論:1.益氣健脾法及益氣健脾抗癌法對大腸癌均具有治療作用,且在促使腫瘤細胞凋亡、控制大腸癌微血管形成等方面具有一定功效,益氣健脾法與抗癌法聯(lián)合應(yīng)用后療效得到進一步的提高。2.益氣健脾法對pkc、pkcε的mrna及蛋白具有抑制作用,且益氣健脾法與抗癌法聯(lián)合應(yīng)用時這種抑制作用明顯增強。益氣健脾法能促進pkcδmrna及pkcδ蛋白,當益氣健脾法與抗癌法聯(lián)合應(yīng)用時這種促進作用更加明顯。益氣健脾抗癌法通過對大腸癌組織pkc、pkcε的抑制及pkcδ的促進作用,最終實現(xiàn)了對大腸癌細胞生長的抑制,這可能是益氣健脾抗癌法治療大腸癌的作用機理之一。3.益氣健脾抗癌法能控制腫瘤血管形成相關(guān)的pkcα、pkcβmrna之類的調(diào)控基因、抑制其蛋白表達,以及控制腫瘤血管形成基因vegfmrna、抑制其蛋白表達,從而發(fā)揮對腫瘤血管的抑制作用,對vegf、pkcα、pkcβ三方面的影響可能是其重要的作用機理。
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【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R273

【參考文獻】

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本文編號：2500588