【摘要】：惡性腫瘤的中醫(yī)“伏毒”學說認為,“伏毒”是潛藏于人體的致病邪毒,在手術、放化療等治療手段后仍殘余存在,具有伏而不覺、發(fā)時始顯的病理特性,有較強的沿氣血通道播散的能力,發(fā)病則毒性猛烈、病情危重或遷延難祛。這與現(xiàn)代醫(yī)學的腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells, CSCs)導致惡性腫瘤轉移的認識非常相似。加之既往研究表明,血小板可促進腫瘤細胞的血行轉移。那么我們有理由設想,腫瘤干細胞作為腫瘤轉移的起源,與普通腫瘤細胞相比,是否有更強的活化血小板、逃避免疫監(jiān)視從而促進腫瘤血行轉移的作用。因此本研究受中醫(yī)“伏毒”學說啟發(fā),擬從腫瘤干細胞和血小板包被、免疫逃逸的角度探索腫瘤轉移的機制,并觀察基于中醫(yī)“伏毒”學說的“扶正祛毒方”(reinforce the healthy qi and dispel toxin formula, RHDT)對 4T1細胞系干細胞(4T1-CSCs)活化血小板、逃避免疫監(jiān)視的干預作用,為扶正祛毒方防治腫瘤轉移提供實驗依據(jù),為中醫(yī)藥特異性靶向調控腫瘤干細胞提供理論依據(jù)。研究目的1.明確乳腺癌干細胞高效表達組織因子,誘導血小板活化,逃避免疫監(jiān)視而轉移的機制；2.探索扶正祛毒方對乳腺癌干細胞基于組織因子而活化血小板逃避免疫監(jiān)視的調控作用。研究方法1.采用乳腺癌4T1細胞系,通過懸浮球狀培養(yǎng)法分離富集、培養(yǎng)純化出乳腺癌干細胞微球(Tumor Spheres),并用流式細胞儀鑒定其干細胞表型。將4T1或4T1-CSCs分別與水洗血小板在血小板聚集儀的剪切力下相互作用,通過免疫熒光法分析4T1或4T1-CSCs與血小板的黏附情況：通過流式細胞儀檢測血小板表面活化標志物CD62p的表達,以及用ELISA法檢測血小板經4T1或4T1-CSCs誘導活化后釋放TGF-β1的含量,觀察4T1或4T-CSCs誘導血小板活化的情況。再將血小板經4T1或4T-CSCs誘導活化后產生的上清加入小鼠脾臟NK細胞中孵育,通過流式細胞儀檢測NK細胞CD107a和NKG2D受體的表達,比較血小板經4T1或4T-CSCs誘導活化后產生的不同上清對NK細胞的抑制作用。然后通過Western-Blot法比較4T1及4T1-CSCs表面組織因子表達的差異。2.通過CCK8法觀察扶正祛毒方在不同濃度、不同時間點對4T1或4T1-CSCs細胞增殖的影響。將扶正祛毒方干預后的4T1或4T1-CSCs與水洗血小板在血小板聚集儀中作用,通過流式細胞儀檢測及ELISA法,觀察扶正祛毒方對4T1或4T1-CSCs活化血小板作用的影響。再將血小板經藥物干預后的4T1或4T1-CSCs誘導活化后,產生的上清加入NK細胞中孵育,通過流式細胞術觀察扶正祛毒方干預后的細胞誘導的活化血小板上清對NK細胞抑制作用的變化。然后通過Western-Blot法檢測藥物干預后的4T1或4T1-CSCs表面組織因子含量的差異。研究結果1.接種于無血清培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期4T1細胞可形成Tumor Spheres,三代以上相對純化,流式細胞術鑒定其高表達乳腺癌干細胞表型CD24-/lowCD44+。通過免疫熒光分析可見,無論是4T1還是4T1-CSCs,其表面都包被了大量血小板,形成一層保護膜圍繞在腫瘤細胞表面,甚至將腫瘤細胞連接成團、成片。2.流式細胞儀結果顯示,未加激活劑的單純血小板組CD61+CD62p+細胞僅占(3.467±0.603)%,4T1活化血小板組、4T1-CSCs活化血小板組的CD61+CD62p+細胞比例都高于膠原活化血小板組(P0.01),且4T1-CSCs活化血小板組明顯高于4T1活化血小板組(P0.01)。3.流式細胞儀結果顯示,單純NK細胞組CD107a自發(fā)熒光較少,4T1或4T1-CSCs活化血小板上清作用于NK后,都使NK細胞CD107a表達明顯下降(P0.01)。且4T1-CSCs活化血小板上清組的NK殺傷活性抑制率明顯高于4T1活化血小板上清組(P0.05)。4.流式細胞儀結果顯示,4T1活化血小板上清組NKG2D的特異熒光指數(shù)水平(specific fluorescence index, SF I)明顯低于單純NK細胞組(P0.05),4T1-CSCs活化血小板上清組也明顯低于單純NK細胞組(P0.01)。雖然4T1活化血小板上清組和4T1-CSCs活化血小板上清組NKG2D的SFI沒有明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),但在數(shù)據(jù)上看后者有小于前者的趨勢。5.ELISA法檢測結果顯示,4T1活化血小板組的TGF-β1含量高于膠原活化血小板組(P0.05),而4T1-CSCs活化血小板組也高于膠原活化血小板組(P0.01),且4T1-CSCs活化血小板組明顯高于4T1活化血小板組(P0.01)。6. Western-Blot檢測結果顯示,4T1-CSCs表面組織因子(tissue factor, TF)蛋白含量高于4T1細胞(P0.05)。7.CCK8檢測結果顯示,48h扶正祛毒方干預4T1-CSCs的IC50為13.55 mg/ml,干預4T1的IC50為10.4mg/ml;48h可司匹林(Asprin)干預4T1-CSCs的IC50為3.469mM,干預4T1的IC50為1.768mM。8.藥物干預后,流式細胞儀血小板活化率(CD61+CD62p+%)結果顯示,較之4T1活化血小板組,Asprin干預的4T1活化血小板組和RHDT干預的4T1活化血小板組的血小板活化率均明顯下降(P0.01),而Asprin干預組和RHDT干預組統(tǒng)計無明顯差異(P0.05)；較之4T1-CSCs活化血小板組,Asprin干預的4T1-CSCs活化血小板組和RHDT干預的4T1-CSCs活化血小板組的血小板活化率均明顯減小(P0.01)，，而Asprin干預組和RHDT干預組無統(tǒng)計學差異(P0.05)。ELISA法檢測TGF-β1含量結果顯示,較之4T1活化血小板組,Asprin干預的4T1活化血小板組和RHDT干預的4T1活化血小板組的含量均明顯減少(P0.01)；較之4T1-CSCs活化血小板組,Asprin干預的4T1-CSCs活化血小板組的含量明顯下降(P0.01),RHDT干預的4T1-CSCs活化血小板組的含量也明顯減少(P0.05)。9.藥物干預后,流式細胞儀NK殺傷活性抑制率結果顯示,與4T1活化血小板上清組比較,Asprin干預的4T1活化血小板上清組和RHDT干預的4T1活化血小板上清組抑制率均明顯減低(P0.01),且RHDT干預組比Asprin干預組更低(P0.01)；與4T1-CSCs活化血小板上清組比較,Asprin干預的4T1-CSCs活化血小板上清組和RHDT干預的4T1-CSCs活化血小板上清組抑制率均明顯減低(P0.01),而RHDT干預組與A sprin干預組沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。流式細胞儀NKG2D的SFI結果顯示,Asprin干預的4T1活化血小板上清組與4T1活化血小板上清組SFI沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)但有大于后者的趨勢,RHDT干預的4T1活化血小板上清組明顯大于4T1活化血小板上清組(P0.05)；Asprin干預的4T1-CSCs活化血小板上清組明顯大于4T1-CSCs活化血小板上清組(P0.05),RHDT干預的4T1-CSCs活化血小板上清組與4T1-CSCs活化血小板上清組沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)但有大于后者的趨勢。10.藥物干預后,Western-Blot檢測細胞TF蛋白含量結果顯示,Asprin干預的4T1-CSCs組和RHDT干預的4T1-CSCs組均較4T1-CSCs組明顯下降(P0.01); Asprin干預的4T1組較4T1組含量下降(P0.05), RHDT干預的4T1組(4T1+RHDT組)與4T1組無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),但前者較后者有下降的趨勢。結論1.4T1和4T1-CSCs都能作為血小板激活劑誘導血小板的黏附聚集和活化,其表面有大量活化血小板包被,且4T1-CSCs較4T1有更強的活化血小板的能力。2.血小板經4T1-CSCs誘導活化后釋放于上清的物質較之4T1有更強的抑制NK細胞殺傷活性的作用,且二者都能顯著抑制NK細胞NKG2D的表達。3.較之4T1,4T1-CSCs有更強的誘導血小板活化釋放T GF-β1的能力,這可能與4T1-CSCs更強的抑制NK細胞作用有關。4.4T1-CSCs較4T1細胞表面表達更多TF,這可能與4T1-CSCs更強的黏附聚集、誘導活化血小板的能力有關。5.扶正祛毒方及對照藥阿司匹林都對4T1或4T1-CSCs的生長有抑制作用,且呈時間劑量依賴性。6.扶正祛毒方可以抑制4T1或4T1-CSCs誘導的血小板活化及血小板釋放TGF-β1。7.扶正祛毒方可以減輕4T1或4T1-CSCs活化血小板上清對NK細胞殺傷活性的抑制作用；使4T1活化血小板上清對NK細胞NKG2D的抑制作用減弱,沒有影響4T1-CSCs活化血小板上清對NKG2D的作用。8.扶正祛毒方可以抑制4T1或4T1-CSCs誘導的血小板活化以及血小板釋放TGF-β1,并且進一步減輕對NK細胞的抑制,可能是源于扶正祛毒方減少了4T1或4T1-CSCs細胞表面的TF表達。
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【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R273

【參考文獻】

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本文編號：2458131