【摘要】：惡性腫瘤的中醫(yī)“伏毒”學(xué)說認(rèn)為,“伏毒”是潛藏于人體的致病邪毒,在手術(shù)、放化療等治療手段后仍殘余存在,具有伏而不覺、發(fā)時(shí)始顯的病理特性,有較強(qiáng)的沿氣血通道播散的能力,發(fā)病則毒性猛烈、病情危重或遷延難祛。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells, CSCs)導(dǎo)致惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)非常相似。加之既往研究表明,血小板可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移。那么我們有理由設(shè)想,腫瘤干細(xì)胞作為腫瘤轉(zhuǎn)移的起源,與普通腫瘤細(xì)胞相比,是否有更強(qiáng)的活化血小板、逃避免疫監(jiān)視從而促進(jìn)腫瘤血行轉(zhuǎn)移的作用。因此本研究受中醫(yī)“伏毒”學(xué)說啟發(fā),擬從腫瘤干細(xì)胞和血小板包被、免疫逃逸的角度探索腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制,并觀察基于中醫(yī)“伏毒”學(xué)說的“扶正祛毒方”(reinforce the healthy qi and dispel toxin formula, RHDT)對(duì) 4T1細(xì)胞系干細(xì)胞(4T1-CSCs)活化血小板、逃避免疫監(jiān)視的干預(yù)作用,為扶正祛毒方防治腫瘤轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為中醫(yī)藥特異性靶向調(diào)控腫瘤干細(xì)胞提供理論依據(jù)。研究目的1.明確乳腺癌干細(xì)胞高效表達(dá)組織因子,誘導(dǎo)血小板活化,逃避免疫監(jiān)視而轉(zhuǎn)移的機(jī)制；2.探索扶正祛毒方對(duì)乳腺癌干細(xì)胞基于組織因子而活化血小板逃避免疫監(jiān)視的調(diào)控作用。研究方法1.采用乳腺癌4T1細(xì)胞系,通過懸浮球狀培養(yǎng)法分離富集、培養(yǎng)純化出乳腺癌干細(xì)胞微球(Tumor Spheres),并用流式細(xì)胞儀鑒定其干細(xì)胞表型。將4T1或4T1-CSCs分別與水洗血小板在血小板聚集儀的剪切力下相互作用,通過免疫熒光法分析4T1或4T1-CSCs與血小板的黏附情況：通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面活化標(biāo)志物CD62p的表達(dá),以及用ELISA法檢測(cè)血小板經(jīng)4T1或4T1-CSCs誘導(dǎo)活化后釋放TGF-β1的含量,觀察4T1或4T-CSCs誘導(dǎo)血小板活化的情況。再將血小板經(jīng)4T1或4T-CSCs誘導(dǎo)活化后產(chǎn)生的上清加入小鼠脾臟NK細(xì)胞中孵育,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞CD107a和NKG2D受體的表達(dá),比較血小板經(jīng)4T1或4T-CSCs誘導(dǎo)活化后產(chǎn)生的不同上清對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用。然后通過Western-Blot法比較4T1及4T1-CSCs表面組織因子表達(dá)的差異。2.通過CCK8法觀察扶正祛毒方在不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)4T1或4T1-CSCs細(xì)胞增殖的影響。將扶正祛毒方干預(yù)后的4T1或4T1-CSCs與水洗血小板在血小板聚集儀中作用,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)及ELISA法,觀察扶正祛毒方對(duì)4T1或4T1-CSCs活化血小板作用的影響。再將血小板經(jīng)藥物干預(yù)后的4T1或4T1-CSCs誘導(dǎo)活化后,產(chǎn)生的上清加入NK細(xì)胞中孵育,通過流式細(xì)胞術(shù)觀察扶正祛毒方干預(yù)后的細(xì)胞誘導(dǎo)的活化血小板上清對(duì)NK細(xì)胞抑制作用的變化。然后通過Western-Blot法檢測(cè)藥物干預(yù)后的4T1或4T1-CSCs表面組織因子含量的差異。研究結(jié)果1.接種于無血清培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)生長期4T1細(xì)胞可形成Tumor Spheres,三代以上相對(duì)純化,流式細(xì)胞術(shù)鑒定其高表達(dá)乳腺癌干細(xì)胞表型CD24-/lowCD44+。通過免疫熒光分析可見,無論是4T1還是4T1-CSCs,其表面都包被了大量血小板,形成一層保護(hù)膜圍繞在腫瘤細(xì)胞表面,甚至將腫瘤細(xì)胞連接成團(tuán)、成片。2.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,未加激活劑的單純血小板組CD61+CD62p+細(xì)胞僅占(3.467±0.603)%,4T1活化血小板組、4T1-CSCs活化血小板組的CD61+CD62p+細(xì)胞比例都高于膠原活化血小板組(P0.01),且4T1-CSCs活化血小板組明顯高于4T1活化血小板組(P0.01)。3.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,單純NK細(xì)胞組CD107a自發(fā)熒光較少,4T1或4T1-CSCs活化血小板上清作用于NK后,都使NK細(xì)胞CD107a表達(dá)明顯下降(P0.01)。且4T1-CSCs活化血小板上清組的NK殺傷活性抑制率明顯高于4T1活化血小板上清組(P0.05)。4.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,4T1活化血小板上清組NKG2D的特異熒光指數(shù)水平(specific fluorescence index, SF I)明顯低于單純NK細(xì)胞組(P0.05),4T1-CSCs活化血小板上清組也明顯低于單純NK細(xì)胞組(P0.01)。雖然4T1活化血小板上清組和4T1-CSCs活化血小板上清組NKG2D的SFI沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但在數(shù)據(jù)上看后者有小于前者的趨勢(shì)。5.ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示,4T1活化血小板組的TGF-β1含量高于膠原活化血小板組(P0.05),而4T1-CSCs活化血小板組也高于膠原活化血小板組(P0.01),且4T1-CSCs活化血小板組明顯高于4T1活化血小板組(P0.01)。6. Western-Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,4T1-CSCs表面組織因子(tissue factor, TF)蛋白含量高于4T1細(xì)胞(P0.05)。7.CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,48h扶正祛毒方干預(yù)4T1-CSCs的IC50為13.55 mg/ml,干預(yù)4T1的IC50為10.4mg/ml;48h可司匹林(Asprin)干預(yù)4T1-CSCs的IC50為3.469mM,干預(yù)4T1的IC50為1.768mM。8.藥物干預(yù)后,流式細(xì)胞儀血小板活化率(CD61+CD62p+%)結(jié)果顯示,較之4T1活化血小板組,Asprin干預(yù)的4T1活化血小板組和RHDT干預(yù)的4T1活化血小板組的血小板活化率均明顯下降(P0.01),而Asprin干預(yù)組和RHDT干預(yù)組統(tǒng)計(jì)無明顯差異(P0.05)；較之4T1-CSCs活化血小板組,Asprin干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板組和RHDT干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板組的血小板活化率均明顯減小(P0.01)，，而Asprin干預(yù)組和RHDT干預(yù)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。ELISA法檢測(cè)TGF-β1含量結(jié)果顯示,較之4T1活化血小板組,Asprin干預(yù)的4T1活化血小板組和RHDT干預(yù)的4T1活化血小板組的含量均明顯減少(P0.01)；較之4T1-CSCs活化血小板組,Asprin干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板組的含量明顯下降(P0.01),RHDT干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板組的含量也明顯減少(P0.05)。9.藥物干預(yù)后,流式細(xì)胞儀NK殺傷活性抑制率結(jié)果顯示,與4T1活化血小板上清組比較,Asprin干預(yù)的4T1活化血小板上清組和RHDT干預(yù)的4T1活化血小板上清組抑制率均明顯減低(P0.01),且RHDT干預(yù)組比Asprin干預(yù)組更低(P0.01)；與4T1-CSCs活化血小板上清組比較,Asprin干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板上清組和RHDT干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板上清組抑制率均明顯減低(P0.01),而RHDT干預(yù)組與A sprin干預(yù)組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。流式細(xì)胞儀NKG2D的SFI結(jié)果顯示,Asprin干預(yù)的4T1活化血小板上清組與4T1活化血小板上清組SFI沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)但有大于后者的趨勢(shì),RHDT干預(yù)的4T1活化血小板上清組明顯大于4T1活化血小板上清組(P0.05)；Asprin干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板上清組明顯大于4T1-CSCs活化血小板上清組(P0.05),RHDT干預(yù)的4T1-CSCs活化血小板上清組與4T1-CSCs活化血小板上清組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)但有大于后者的趨勢(shì)。10.藥物干預(yù)后,Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞TF蛋白含量結(jié)果顯示,Asprin干預(yù)的4T1-CSCs組和RHDT干預(yù)的4T1-CSCs組均較4T1-CSCs組明顯下降(P0.01); Asprin干預(yù)的4T1組較4T1組含量下降(P0.05), RHDT干預(yù)的4T1組(4T1+RHDT組)與4T1組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但前者較后者有下降的趨勢(shì)。結(jié)論1.4T1和4T1-CSCs都能作為血小板激活劑誘導(dǎo)血小板的黏附聚集和活化,其表面有大量活化血小板包被,且4T1-CSCs較4T1有更強(qiáng)的活化血小板的能力。2.血小板經(jīng)4T1-CSCs誘導(dǎo)活化后釋放于上清的物質(zhì)較之4T1有更強(qiáng)的抑制NK細(xì)胞殺傷活性的作用,且二者都能顯著抑制NK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)。3.較之4T1,4T1-CSCs有更強(qiáng)的誘導(dǎo)血小板活化釋放T GF-β1的能力,這可能與4T1-CSCs更強(qiáng)的抑制NK細(xì)胞作用有關(guān)。4.4T1-CSCs較4T1細(xì)胞表面表達(dá)更多TF,這可能與4T1-CSCs更強(qiáng)的黏附聚集、誘導(dǎo)活化血小板的能力有關(guān)。5.扶正祛毒方及對(duì)照藥阿司匹林都對(duì)4T1或4T1-CSCs的生長有抑制作用,且呈時(shí)間劑量依賴性。6.扶正祛毒方可以抑制4T1或4T1-CSCs誘導(dǎo)的血小板活化及血小板釋放TGF-β1。7.扶正祛毒方可以減輕4T1或4T1-CSCs活化血小板上清對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的抑制作用；使4T1活化血小板上清對(duì)NK細(xì)胞NKG2D的抑制作用減弱,沒有影響4T1-CSCs活化血小板上清對(duì)NKG2D的作用。8.扶正祛毒方可以抑制4T1或4T1-CSCs誘導(dǎo)的血小板活化以及血小板釋放TGF-β1,并且進(jìn)一步減輕對(duì)NK細(xì)胞的抑制,可能是源于扶正祛毒方減少了4T1或4T1-CSCs細(xì)胞表面的TF表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R273

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2458131