【摘要】：蒙藥材特穆日-敖日陽(yáng)古為毛茛科鐵線蓮屬植物芹葉鐵線蓮(Clematis aethusifolia Turcz.)的干燥帶花葉枝條,是蒙醫(yī)常用的破痞去滯藥,《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊(cè))收載。具破痞,燥“協(xié)日烏素”,止腐,消腫,止瀉之功效,常用于治療各種寒痞、食積、水腫、創(chuàng)瘍、痔瘡等,現(xiàn)代臨床用于治療各種腫瘤,包括癌癥。目的通過(guò)對(duì)蒙藥特穆日-敖日陽(yáng)古抗腫瘤活性部位和成分的研究,尋找蒙藥破痞去滯功效與抗腫瘤活性之間的內(nèi)在聯(lián)系,用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論闡釋特穆日-敖日陽(yáng)古破痞去滯功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理,為傳統(tǒng)蒙藥臨床合理用藥提供新思路。方法及結(jié)果(1)化學(xué)成分分離及鑒定:采用Sephadex LH-20、大孔樹(shù)脂、反相C_(18)柱色譜和制備高效液相等方法,對(duì)蒙藥特穆日-敖日陽(yáng)古的醇提物進(jìn)行分離純化,并運(yùn)用1D,2D-NMR,HRMS等波譜分析法和文獻(xiàn)對(duì)照法鑒定化合物結(jié)構(gòu)。從特穆日-敖日陽(yáng)古的正丁醇及乙酸乙酯萃取層分離得到15個(gè)化合物,分別為(3R)-6,7,8-trimethoxy-2,3,4,5-tetrahydrobenz-1-oxepin-3-ol(1),3-O-p-coumaroyl-2-C-methyl-D-erythrono-1,4-lactone(2),4-O-caffeoyl-2-C-methyl-D-erythrono acid(3),4-O-Caffeoyl-2-C-methyl-D-erythrono-1,4-lactone(4),(-)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone(5),咖啡酸(6),1-O-咖啡�；�-α-D-吡喃葡萄糖苷(7),苯基-a-L-呋喃阿拉伯糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(8),七葉內(nèi)酯(9),東莨菪內(nèi)酯(10),芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(11),3'-氧甲基-芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(12),香草酸(13),原兒茶酸(14),正丁基-β-D-呋喃果糖苷(15)。(2)細(xì)胞毒活性檢測(cè):采用CCK-8細(xì)胞染色法檢測(cè)課題組分離得到的從特穆日-敖日陽(yáng)古中的38個(gè)單體化合物對(duì)5株常見(jiàn)人體實(shí)體瘤細(xì)胞系(人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人卵巢癌細(xì)胞系SK-OV-3、人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)-375、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y和人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系HCT-15)的生長(zhǎng)抑制作用。其中1-O-咖啡�；�-α-D-吡喃葡萄糖苷(7)、七葉內(nèi)酯(9)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(11)、3'-氧甲基-芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(12)和芹菜素(16)對(duì)部分腫瘤細(xì)胞系有顯著的細(xì)胞毒活性,IC_(50)值范圍在15-60μM之間,其余化合物對(duì)所測(cè)試的五種癌細(xì)胞系均無(wú)明顯細(xì)胞毒活性,IC_(50)值100μM。(3)計(jì)算機(jī)腫瘤靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)篩選:通過(guò)DellPower Edge R900分子模擬服務(wù)器將特穆日-敖日陽(yáng)古中分離得到的單體化合物上傳,使用Auto Dock程序進(jìn)行對(duì)14種臨床常見(jiàn)腫瘤靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接,篩選出具有活性抑制作用的癌癥相關(guān)靶標(biāo)。通過(guò)靶點(diǎn)分子對(duì)接得知從特穆日-敖日陽(yáng)古分離得到的單體化合物大部分對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路蛋白激酶BRAF和PI3K抑制作用較強(qiáng)。(4)抗腫瘤機(jī)制研究:采用熒光定量PCR法,檢測(cè)單體化合物七葉內(nèi)酯、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素刺激腫瘤細(xì)胞后PI3K-AKT-m TOR和RAS-RAF-MEK信號(hào)通路上相關(guān)基因ERK_2、RAF、PDK_1和AKT的m RNA變化,結(jié)果顯示用七葉內(nèi)酯處理腫瘤細(xì)胞后,A-375細(xì)胞內(nèi)ERK_2基因的m RNA表達(dá)量顯著降低,其他檢測(cè)基因的m RNA表達(dá)量無(wú)變化;SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)PDK_1基因的m RNA表達(dá)量顯著降低,其他基因的m RNA表達(dá)量無(wú)變化。用芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷處理腫瘤細(xì)胞后,A-375細(xì)胞內(nèi)四種檢測(cè)基因的m RNA表達(dá)量均無(wú)變化;SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)PDK_1基因的m RNA表達(dá)量顯著降低,其他基因的m RNA表達(dá)量無(wú)變化。用芹菜素處理腫瘤細(xì)胞后,A-375細(xì)胞內(nèi)ERK_2基因的m RNA表達(dá)量顯著降低,其他檢測(cè)基因的m RNA表達(dá)量無(wú)變化;SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ERK_2、PDK_1和AKT基因的m RNA表達(dá)量顯著降低,其他檢測(cè)基因的m RNA表達(dá)量無(wú)變化。采用Western blot檢測(cè)單體化合物七葉內(nèi)酯、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素刺激腫瘤細(xì)胞后PI3K-AKT-m TOR及RAS-RAF-MEK信號(hào)通路上相關(guān)蛋白phospho-AKT、AKT、phospho-PDK1、PDK1、phospho-ERK(1/2)和ERK(1/2)表達(dá)的變化。結(jié)果顯示用七葉內(nèi)酯處理腫瘤細(xì)胞后,A-375細(xì)胞內(nèi)六種檢測(cè)蛋白的表達(dá)量均無(wú)變化;SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)phospho-AKT、AKT和phospho-PDK1蛋白表達(dá)量顯著降低,其他檢測(cè)的蛋白表達(dá)量無(wú)變化。用芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷處理腫瘤細(xì)胞后,A-375細(xì)胞內(nèi)phospho-AKT、AKT、PDK1、phospho-ERK(1/2)和ERK(1/2)的蛋白表達(dá)量顯著降低,其他檢測(cè)的蛋白表達(dá)量無(wú)變化;SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)AKT蛋白表達(dá)量顯著降低,其他檢測(cè)的蛋白表達(dá)量無(wú)變化。用芹菜素處理腫瘤細(xì)胞后,A-375細(xì)胞內(nèi)phospho-AKT、AKT、phospho-PDK1、PDK1、phospho-ERK(1/2)和ERK(1/2)的蛋白表達(dá)量均顯著降低;SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)phospho-PDK1、PDK1和phospho-ERK(1/2)蛋白表達(dá)量顯著降低,其他檢測(cè)的蛋白表達(dá)量無(wú)變化。結(jié)論化合物1 15均從特穆日-敖日陽(yáng)古中首次分離得到,其中化合物1 3為新化合物,4,5,8,15為毛茛科內(nèi)首次分離,7,9,12為鐵線蓮屬內(nèi)首次分離;細(xì)胞毒活性檢測(cè)與抗腫瘤機(jī)制研究結(jié)果提示七葉內(nèi)酯(9)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(11)和芹菜素(16)具有抗腫瘤活性,并通過(guò)PI3K-AKT-m TOR和/或RAS-RAF-MEK信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R29

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2448090