【摘要】：[目的]研究推拿在軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向機(jī)制以及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,以進(jìn)一步揭示推拿促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)的機(jī)理,完善推拿治療周圍神經(jīng)損傷的理論基礎(chǔ),為臨床應(yīng)用推拿治療周圍神經(jīng)損傷疾病,改善患者的癥狀及預(yù)后提供有力科學(xué)證據(jù)。[方法]采用按摩推拿手法模擬儀模擬推拿手法,對(duì)坐骨神經(jīng)損傷(Sciatic Nerve Injury, SNI)模型大鼠進(jìn)行定性、定量干預(yù),再通過(guò)以下三方面研究推拿對(duì)軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向機(jī)制的影響：1通過(guò)斜板試驗(yàn)和光熱耐痛閾觀察大鼠行為學(xué)情況,采用透射電鏡觀察并分析坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)軸突、髓鞘、雪旺細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)的改變,從而進(jìn)一步探尋推拿促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)的形態(tài)學(xué)證據(jù)。2在得出推拿治療周圍神經(jīng)損傷的超微形態(tài)學(xué)證據(jù)基礎(chǔ)上,通過(guò)免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)方法,檢測(cè)L3-L5節(jié)段脊髓腹角、坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)中軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子及其受體等相關(guān)指標(biāo)的變化,闡釋推拿對(duì)軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向機(jī)制的影響。3為進(jìn)一步驗(yàn)證推拿是否能夠調(diào)控軸突生長(zhǎng)的導(dǎo)向,采用Rho GTPase抑制劑NSC23766阻斷軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向機(jī)制中Rho GTPase信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),觀察大鼠坐骨神經(jīng)功能的改變情況,檢測(cè)坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)處神經(jīng)元骨架蛋白F-actin和Tublin的表達(dá)變化,分析推拿是否通過(guò)調(diào)控軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向機(jī)制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)錐的細(xì)胞骨架,進(jìn)而使再生神經(jīng)的生長(zhǎng)得到精確導(dǎo)向,從而恢復(fù)靶器官的功能。[結(jié)果]1推拿可以促進(jìn)SNI模型大鼠神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的恢復(fù)1.1行為學(xué)結(jié)果：推拿組造模后7d的行為學(xué)表現(xiàn)與模型組相同(P0.05),經(jīng)推拿治療20次后,大鼠的斜板試驗(yàn)與光熱耐痛閾結(jié)果與模型組相比均有顯著差異(P0.05),且接近假手術(shù)組水平(P0,05),說(shuō)明經(jīng)過(guò)推拿治療,大鼠的運(yùn)動(dòng)和感覺功能均得到了一定程度的恢復(fù)。1.2電鏡觀察結(jié)果：電鏡下模型組造模后28d的髓鞘嚴(yán)重?fù)p傷,髓鞘結(jié)構(gòu)模糊、松散,出現(xiàn)空泡狀變性,軸索萎縮或消失,雪旺細(xì)胞線粒體空泡化,細(xì)胞趨于壞死,表明神經(jīng)受損嚴(yán)重,且與所觀察到的大鼠行為學(xué)表現(xiàn)相一致。與模型組比較,經(jīng)過(guò)推拿治療20次后治療組大鼠坐骨神經(jīng)電鏡下僅見部分髓鞘分層、空泡化,軸索無(wú)明顯腫脹,部分線粒體發(fā)生腫脹、嵴斷裂或空泡化,雪旺細(xì)胞部分空泡化或線粒體水腫,損傷程度較模型組輕。推拿組有髓神經(jīng)的髓鞘厚度和軸突直徑與模型組比較,均有顯著性升高(P0.05),且逐漸接近假手術(shù)組水平(P0.05)。以上結(jié)果提示：推拿對(duì)周圍神經(jīng)損傷后超微結(jié)構(gòu)的修復(fù)和再生有明顯的促進(jìn)作用,為推拿對(duì)SNI大鼠神經(jīng)損傷恢復(fù)提供了超微形態(tài)學(xué)證據(jù)。2推拿可以促進(jìn)SNI模型大鼠軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子及其受體的表達(dá)2.1軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrin1及其mRNA的表達(dá)變化干預(yù)0次,在L3-L5節(jié)段脊髓腹角和坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)中Netrinl平均積分光密度、相對(duì)蛋白含量以及mRNA表達(dá)量,模型組、模型對(duì)照組和推拿組與正常組相比均有顯著性增高(P0.05),假手術(shù)組與正常組相比無(wú)差異(P0.05)。干預(yù)20次后,模型組、模型對(duì)照組和推拿組仍顯著高于正常組(P0.05),模型組和模型對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),推拿組與模型組、模型對(duì)照組相比有顯著性增高(P0.05)。2.2軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrin1的受體DCC的表達(dá)變化干預(yù)0次,模型組、模型對(duì)照組和推拿組的脊髓和神經(jīng)中DCC平均積分光密度與正常組相比均有顯著性增高(P0.05),假手術(shù)組與正常組相比無(wú)差異(P0.05)。干預(yù)20次后,脊髓中模型組、模型對(duì)照組和推拿組仍顯著高于正常組(P0.05),模型組和模型對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),推拿組與模型組和模型對(duì)照組相比有顯著性增高(P0.05)；而在神經(jīng)中模型組、模型對(duì)照組與正常組相比已無(wú)差異(P0.05),但推拿組仍顯著高于正常組(P0.05),與模型組和模型對(duì)照組相比也有顯著性差異(P0.05)。2.3軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Netrinl的受體UNC5A的表達(dá)變化干預(yù)0次,模型組、模型對(duì)照組和推拿組的脊髓和神經(jīng)中UNC5A平均積分光密度與正常組相比均有顯著性增高(P0.01),假手術(shù)組與正常組相比無(wú)差異(P0.05)。干預(yù)20次后,脊髓中模型組、模型對(duì)照組和推拿組仍顯著高于正常組(P0.05),模型組和模型對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),推拿組與模型組和模型對(duì)照組相比有顯著性增高(P0.05)；而神經(jīng)中模型組、模型對(duì)照組和推拿組仍顯著高于正常組(P0.01),模型組和模型對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),推拿組與模型組和模型對(duì)照組相比有顯著性增高(P0.01)。2.4軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Slit2及其mRNA的表達(dá)變化干預(yù)0次,在L3-L5節(jié)段脊髓腹角和坐骨神經(jīng)損傷點(diǎn)中Slit2平均積分光密度、相對(duì)蛋白含量以及mRNA表達(dá)量,模型組、模型對(duì)照組和推拿組與正常組相比均有顯著性增高(P0.05),假手術(shù)組與正常組相比無(wú)差異(P0.05)。干預(yù)20次后,模型組、模型對(duì)照組和推拿組仍顯著高于正常組(P0.05),模型組和模型對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),推拿組與模型組和模型對(duì)照組相比有顯著性增高(P0.05)。2.5軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Slit2的受體Robo1的表達(dá)變化干預(yù)0次,模型組、模型對(duì)照組和推拿組的脊髓和神經(jīng)中Robo1平均積分光密度與正常組相比均有顯著性增高(P0.05),假手術(shù)組與正常組相比無(wú)差異(P0.05)。干預(yù)20次后,脊髓中模型組、模型對(duì)照組和推拿組仍顯著高于正常組(P0.01),但三組之間無(wú)顯著性差異(P0.05)；而神經(jīng)中模型組和模型對(duì)照組仍顯著高于正常組(P0.05),且兩組之間無(wú)顯著性差異(P0.05),推拿組與正常組相比差異極其顯著(P0.01),與模型組和模型對(duì)照組相比也有明顯增高(P0.05)。以上結(jié)果提示：推拿能夠同時(shí)促進(jìn)SNI大鼠神經(jīng)損傷點(diǎn)和L3-L5節(jié)段脊髓中軸突導(dǎo)向因子Netrin1及其受體DCC/UNC5A的合成和分泌；推拿可以促進(jìn)SNI大鼠神經(jīng)損傷點(diǎn)和相應(yīng)脊髓節(jié)段中軸突導(dǎo)向因子Slit2的表達(dá),但只能促進(jìn)神經(jīng)中Slit2受體Robo1的表達(dá)；推拿能維持SNI大鼠神經(jīng)損傷點(diǎn)Netrin1受體DCC/UNC5A之間,Netrin1和Slit2之間在時(shí)間表達(dá)變化上的均衡。3推拿可以通過(guò)Rho GTPase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響軸突導(dǎo)向3.1坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)結(jié)果：在造模后1d、造模后7d(干預(yù)0次),模型組、推拿組、推拿+抑制劑組和推拿+鹽水組的SFI結(jié)果與假手術(shù)組相比均有顯著性降低(P0.01)。造模后14d,四組仍顯著低于假手術(shù)組(P0.01),但推拿組和推拿+鹽水組與造模后7d相比有一定升高。造模后21d,模型組和推拿+抑制劑組仍顯著低于假手術(shù)組(P0.01)；推拿組和推拿+鹽水組與模型組相比有顯著性升高(P0.05),且已與正常組無(wú)顯著性差異(P0.05)；推拿+抑制劑組要高于模型組(P0.05),但顯著低于推拿組和推拿+鹽水組(P0.05)。造模后28d,四組與造模后21d相比,均有一定程度恢復(fù)；模型組和推拿+抑制劑組雖有一定升高,但仍低于假手術(shù)組(P0.05)；推拿組和推拿+鹽水組與模型組相比有顯著性升高(P0.05),且已基本達(dá)到正常組水平(P0.05)；推拿+抑制劑組要高于模型組(P0.05),但仍低于推拿組和推拿+鹽水組(P0.05)。3.2細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)結(jié)果：干預(yù)0次,模型組、推拿組、推拿+抑制劑組和推拿+鹽水組的F-actin和Tublin的平均積分光密度與假手術(shù)組相比均有顯著性降低(P0.05)。干預(yù)20次后,四組仍顯著低于假手術(shù)組(P0.05),但推拿組和推拿+鹽水組與模型組相比有明顯升高(P0.05),推拿+抑制劑組與模型組相比沒有差異(P0.05),且明顯低于推拿組和推拿+鹽水組(P0.05)。免疫熒光結(jié)果與免疫組化基本一致：假手術(shù)組的F-actin和Tublin在干預(yù)0次和干預(yù)20次時(shí)均可見大量綠色熒光著色的免疫陽(yáng)性顆粒,亮度高,著色深,熒光強(qiáng)度明顯高于其他各組；模型組的F-actin和Tublin在干預(yù)0次和干預(yù)20次時(shí)均只見少量綠色熒光陽(yáng)性顆粒,干預(yù)20次時(shí)熒光強(qiáng)度明顯弱于其他各組；推拿組和推拿+鹽水組熒光強(qiáng)度和著色分布肉眼難以區(qū)分差別,但干預(yù)20次后,二者的著色深度與模型組比較,熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；干預(yù)20次后,推拿+抑制劑組著色顆粒少于推拿組和推拿+鹽水組,但熒光強(qiáng)度仍高于模型組。以上結(jié)果提示：軸突導(dǎo)向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子Rho GTPase被抑制后,推拿對(duì)細(xì)胞骨架蛋白中肌動(dòng)蛋白F-actin和微管蛋白Tublin的表達(dá)促進(jìn)作用以及坐骨神經(jīng)功能都受到了抑制。[結(jié)論]1推拿可以促進(jìn)SNI大鼠坐骨神經(jīng)纖維髓鞘的再生,軸索的恢復(fù),減輕雪旺細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體的水腫,對(duì)周圍神經(jīng)損傷后超微結(jié)構(gòu)的修復(fù)和再生有明顯的促進(jìn)作用,為推拿治療周圍神經(jīng)損傷類疾病提供了超微形態(tài)學(xué)證據(jù)。2推拿能夠促進(jìn)軸突導(dǎo)向因子Netrin1及其受體DCC/UNC5A,Slit2及其受體Robol的表達(dá),并能維持它們所介導(dǎo)的吸引和排斥信號(hào)的相互制約平衡,這可能是推拿能夠促進(jìn)軸突精確導(dǎo)向,重新成功支配靶器官的機(jī)制之一。3推拿可以通過(guò)軸突導(dǎo)向信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白F-actin和Tublin的表達(dá),調(diào)控再生軸突細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重建和運(yùn)動(dòng),從而影響軸突的定向生長(zhǎng),完成神經(jīng)的再生修復(fù)。以上結(jié)論相互印證,說(shuō)明了推拿可以通過(guò)軸突導(dǎo)向機(jī)制調(diào)控再生軸突的生長(zhǎng)和導(dǎo)向,表現(xiàn)為神經(jīng)形態(tài)和功能上的恢復(fù),最終使靶器官得到正確的再支配,從而促進(jìn)了周圍神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)、肌肉,感覺、運(yùn)動(dòng)等各癥狀的恢復(fù)。
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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R244.1
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本文編號(hào)：2430771