【摘要】：目的：通過建立體外血腫瘤屏障模型(blood-tumor barrier, BTB),研究天然冰片通過MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路開放血腫瘤屏障的分子機(jī)制以及對BTB模型上緊密連接蛋白的調(diào)控作用；闡明天然冰片調(diào)節(jié)血腫瘤屏障開放的效果和機(jī)制,詮釋其“芳香開竅、引藥上行”的科學(xué)內(nèi)涵,也為臨床上神經(jīng)膠質(zhì)瘤等顱內(nèi)疾病的治療開辟一條新的途徑。方法：1.體外BTB細(xì)胞模型的建立。大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)非接觸共培養(yǎng)建立體外BTB細(xì)胞模型。2.天然冰片對血腫瘤屏障模型通透性的影響實驗分4組：空白對照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組(100μg/mL),每組3個復(fù)孔。跨細(xì)胞阻值和HRP流量測定不同劑量天然冰片對BTB通透性的影響。3.天然冰片對MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)激酶表達(dá)的影響。實驗分4組：空白對照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組(100μg/mL),每組3個復(fù)孔。Western blot柃測不同劑量的天然冰片對MAPKs通路相關(guān)激酶JNK、ERK、p38及其磷酸(p-JNK、p-ERK、和p-p38)表達(dá)的影響。4.天然冰片和U0126合用對緊密連接相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)及血腫瘤屏障通透性的影響。選擇ERK信號通路特異性抑制劑U0126,實驗分8組：空白對照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組(100μg/mL)、U0126組、U0126+冰片低劑量組、U0126+冰片中劑量組、U0126+冰片高劑量組,每組3個復(fù)孔�？缂�(xì)胞阻值和HRP流量測定不同組別的BTB通透性；Western blot檢測不同組別激酶ERK和p--ERK以及緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、F-actin和ZO-1的表達(dá);RT-PCR檢測不同組別緊密連接相關(guān)基因Claudin-5、F-actin和ZO-1的表達(dá)。5.冰片和Sorafenib Tosylate (ST)合用緊密連接相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)及血腫瘤屏障通透性的影響。本實驗進(jìn)一步對RAF/MEK/ERK信號通路的上游RAF位點進(jìn)行研究。選擇Raf特異性抑制劑ST,實驗分8組：空白對照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組(100μg/mL)、ST組、ST+冰片低劑量組、ST+冰片中劑量組、ST+冰片高劑量組,每組3個復(fù)孔�？缂�(xì)胞阻值和HRP流量測定各組別的BTB通透性；Western blot檢測各組別激酶Rafl和p-Raf1以及緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、F-actin口ZO-1的表達(dá)；RT-PCR檢測各組別緊密連接相關(guān)基因Claudin-5、 F-actin和Z0-1的表達(dá)。結(jié)果：1.成功建立了體外BTB細(xì)胞模型,可模擬體內(nèi)血腫瘤屏障環(huán)境,用于藥物跨血腫瘤屏障特性方面的研究。2.跨細(xì)胞阻值測定天然冰片對BTB細(xì)胞模型通透性的影響,結(jié)果顯示：與空白對照組相比,天然冰片低、中、高劑量組(25、50、100μg/mL)的細(xì)胞電阻值均隨著作用時間的延長先逐漸降低,各組均在30min降低最明顯,120-240min時逐漸恢復(fù)正常水平。同一時間點電阻值的變化呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(P0.01)。HRP流量測定天然冰片對BTB細(xì)胞模型通透性的影響,結(jié)果顯示：與空白對照組相比,天然冰片低、中、高(25、50、100μg/mL)的HRP通透率均隨著作用時間的延長逐漸提高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；且同一時間點HRP通透率的提高呈現(xiàn)劑量依賴趨勢,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。從相鄰時間點的透過率差值分析,低、中、高劑量組均在10-30min、 30-60min時,HRP透過率提升最明顯,60-120min時通透率增加幅度降低,120-240min時,通透率恢復(fù)正常水平。3. Western blot檢測天然冰片對MAPKs信號通路激酶ERK、p-ERK、p38、p-p38. JNK、p-JNK表達(dá)的影響,結(jié)果顯示：ERK蛋白在不同時間點間及不同組別間沒有顯著性的變化,p-ERK蛋白的表達(dá)量隨作用時間的延長先升高,然后又逐漸恢復(fù)至藥前水平,30mi n時表達(dá)量最高,并且存在劑量依賴性(p0.05; p38蛋白在不同時間點間及不同組別間沒有顯著性的變化；JNK蛋白在不同時間點間及不同組別間沒有顯著性的變化,p-JNK蛋白表達(dá)在120min內(nèi)無明顯變化,180-240min開始明顯降低,且存在一定的劑量依賴趨勢(p0.05)。4.細(xì)胞電阻值測定結(jié)果顯示：與空白對照組相比,U0126組的細(xì)胞電阻值明顯升高,冰片組的細(xì)胞電阻值降低,差異具有具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01);與冰片組相比,U0126合用組的細(xì)胞阻值明顯升高(p0.05)。HRP流量測定結(jié)果顯示：與空白對照組相比,U0126組的HRP通透率明顯降低,冰片各組的HRP通透率明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01)；與冰片組相比,U0126合用組的HRP通透率明顯降低(p0.05)。Western blot測定ERK、p-ERK蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與空白對照組相比, U0126組的p-ERK表達(dá)明顯降低(p0.01),冰片各組的ERK、p-ERK表達(dá)明顯升高(p0.01)；與冰片組相比,U0126合用組的ERK、p-ERK表達(dá)明顯降低(p0.05)；Western blot測定Claudin、Z0-1、F-actin蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與空白對照組相比,U0126組的Claudin-5、-Z0-1、F-actin的蛋白表達(dá)明顯升高,冰片組的Claudin-5、Z0-1、 F-actin的蛋白表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01);與冰片組相比,U0126合用組的Claudin-5、Z0-1、F-actin的蛋白表達(dá)均明顯升高(p0.05)。RT-PCR測定Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表達(dá)變化,結(jié)果顯示：與空白對照組相比,U0126組的Claudin-5、Z0-1、F-actin基因表達(dá)明顯升高,冰片組的Claudin-5、Z0-1、 F-actin基因表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01);與冰片組相比,U0126合用組的Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表達(dá)均明顯升高,與蛋白變化結(jié)果一致。5.跨細(xì)胞電阻值測定結(jié)果顯示：與空白對照組相比,ST組的細(xì)胞電阻值明顯升高,冰片組的細(xì)胞電阻值明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01);與冰片組相比,ST合用組的細(xì)胞電阻值明顯升高(p0.05)。HRP流量測定結(jié)果顯示：與空白對照組相比,ST組的HRP通透率明顯降低,冰片組的HRP通透率明顯提高,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01);與冰片組相比,ST合用組的通透率明顯降低(p0.05)。Western blot方法測定Raf1、p-Raf1的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與空白對照組相比,ST組的Raf1、p-Raf1表達(dá)明顯降低,冰片組的Raf1、p-Raf1表達(dá)明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01)；與冰片組相比,ST合用組的Raf1與p-Raf1表達(dá)明顯降低(p0.05)。Western blot方法測定緊密連接蛋白Claudin-5、Z0-1、F-actin的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與空白對照組相比,ST組蛋白Claudin-5、Z0-1、F-actin的表達(dá)明顯升高,冰片組的Claudin-5、Z0-1、F-actin的表達(dá)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01)；與冰片組相比,ST合用組的Claudin-5、Z0-1、F-actin的蛋白表達(dá)均明顯升高(p0.05)、RT-PCR測定Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表達(dá),結(jié)果顯示：與空白對照組相比,ST組的Claudin-5、Z0-1、F-actin基因表達(dá)明顯升高,冰片組的Claudin-5、Z0-1、F-actin基因表達(dá)明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01)；與冰片組相比,ST合用組的Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因表達(dá)均明顯升高,趨勢與蛋白變化一致。結(jié)論：天然冰片通過激活RAF/MEK/ERK/MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而調(diào)控下游相關(guān)緊密連接蛋白Claudin-5、Z0-1、F-actin的基因、蛋白表達(dá)和和分布,從而調(diào)節(jié)BTB的通透性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R273

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本文編號：2400849