【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)H.pylori感染以及頭花蓼治療后SD大鼠固有免疫應(yīng)答中重要的模式識(shí)別分子TLR4和DC-SIGN的蛋白和基因水平,以及胃腸激素GAS、SS m RNA表達(dá)變化,探討頭花蓼抗H.pylori可能的機(jī)制和調(diào)節(jié)和修復(fù)的作用,為臨床研究治療H.pylori感染的慢性胃炎及新藥的研發(fā)提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)H.pylori SS2000的培養(yǎng):將SS2000均勻涂布于哥倫比亞血瓊脂上,37℃三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況,穩(wěn)定傳代3次后進(jìn)行H.pylori鑒定;(2)建立H.pylori感染SD大鼠的慢性胃炎動(dòng)物模型:SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后,將96只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為模型組(70只)、空白組(16只)以及藥物空白組(16只),所有SD大鼠禁食不禁水12h,5g/L的Na HCO3和消炎痛混合液進(jìn)行預(yù)處理,雄鼠1.0m L/只,雌鼠0.5m L/只;灌胃后繼續(xù)禁食不禁水,6h后模型組給予1×109cfu/m L H.pylori SS2000菌液1.5m L,灌胃后禁食禁水4h,隔天灌胃,共5次,空白組及藥物空白組以等量的無(wú)菌腦心浸液肉湯代替;(3)感染動(dòng)物模型鑒定:末次灌胃結(jié)束后8w,禁食禁水24h,模型組及空白組隨機(jī)抽取6只SD大鼠進(jìn)行處死,按照洛桑標(biāo)準(zhǔn),將胃竇黏膜進(jìn)行HE染色,觀察SD大鼠胃黏膜發(fā)生慢性炎癥改變;對(duì)SD大鼠胃黏膜進(jìn)行快速尿素酶實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌微需氧培養(yǎng)及改良W-S銀染法檢測(cè)胃黏膜H.pylori的定植。模型組SD大鼠胃黏膜呈現(xiàn)慢性炎癥病理改變并有H.pylori定植,證實(shí)慢性胃炎動(dòng)物模型構(gòu)建成功;(4)藥物治療:成功造模后,將造模組分為4組(16只/組)分別進(jìn)行頭花蓼高、中、低劑量藥物連續(xù)治療2w,模型組不予治療。藥物空白組以高劑量頭花蓼給正常SD大鼠,空白組正常飼養(yǎng)。末次灌胃2w后,處死SD大鼠取其胃組織(處死前禁食禁水24h),取出胃黏膜組織胃竇部分,將其分為4份,一份裝入腦心浸液肉湯保存液中,進(jìn)行H.pylori微需氧培養(yǎng);一份進(jìn)行快速尿素酶實(shí)驗(yàn)(試紙法);一份裝入樣品保護(hù)液中,凍存于-80℃的冰箱中,用于RNA提取;一份放入配好的福爾馬林固定液中,進(jìn)行組織切片,用于HE染色、免疫組化等;(5)頭花蓼效果評(píng)價(jià):H.pylori的清除率;HE染色觀察胃黏膜淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況;(6)以頭花蓼效果最好的劑量作為治療組,采用免疫組化和real-time PCR的方法檢測(cè)頭花蓼治療前后SD大鼠固有免疫應(yīng)答中重要模式識(shí)別分子DC-SIGN、TLR4的蛋白和基因水平表達(dá)變化;(7)采用原位雜交法檢測(cè)GAS(Gastrin,Gas)、SS(Somatostatin,SS)的m RNA的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)H.pylori SS2000鑒定:尿素酶、觸酶、氧化酶、革蘭染色觀察證實(shí)確為H.pylori SS2000;(2)接種H.pylori后8w,經(jīng)模型鑒定,HE染色結(jié)果顯示模型組SD大鼠胃黏膜均呈現(xiàn)慢性炎癥改變,胃黏膜H.pylori培養(yǎng)、胃黏膜快速尿素酶陽(yáng)性、Giemsa染色有H.pylori定植,證實(shí)H.pylori感染SD大鼠慢性胃炎的動(dòng)物模型構(gòu)建成功;(3)頭花蓼治療效果:經(jīng)SD大鼠胃黏膜H.pylori培養(yǎng)結(jié)果顯示,頭花蓼藥物不同劑量作用以后,H.pylori的定植密度有不同程度的降低,頭花蓼高劑量組(172.29mg浸膏/m L)清除率為91.573%,頭花蓼中劑量組(57.43mg浸膏/m L)清除率為78.200%,頭花蓼低劑量組(19.14mg浸膏/m L)清除率為76.327%;頭花蓼不同劑量對(duì)胃黏膜的炎癥改善情況有所不同;(4)免疫組化結(jié)果顯示,TLR4、DC-SIGN主要在胃黏膜上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá),在空白組中,上皮細(xì)胞構(gòu)成規(guī)則的腺體,未見(jiàn)表達(dá),模型組中,TLR4、DC-SIGN表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性,H.pylori上調(diào)了TLR4、DC-SIGN的表達(dá)水平,分別上調(diào)1.6倍和3.2倍(P0.01),經(jīng)頭花蓼治療后的,陽(yáng)性表達(dá)減弱,分別下調(diào)了1.33倍和2.6倍(P0.01),頭花蓼空白組與空白組相比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;(5)real-time PCR結(jié)果顯示:H.pylori刺激后,模型組的TLR4 m RNA和DC-SIGN m RNA表達(dá)量明顯上調(diào),分別是2.7倍和3倍(P0.05),經(jīng)頭花蓼作用后,TLR4m RNA與DC-SIGN m RNA的表達(dá)水平有明顯的下調(diào)趨勢(shì)(P0.05),分別為1.97倍和1.76倍,空白組與藥物空白組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(6)原位雜交顯示:感染H.pylori后GAS表達(dá)明顯升高,陽(yáng)性表達(dá)較空白組多,通過(guò)掃描灰度值計(jì)算GAS光密度值顯示上調(diào)1.26倍(P0.01),SS表達(dá)明顯下降,光密度值明顯下調(diào)1.19倍(P0.01),頭花蓼作用后GAS下調(diào)1.12倍(P0.05);SS表達(dá)有輕微程度的升高,但不明顯(P0.05)。結(jié)論:(1)頭花蓼高劑量對(duì)H.pylori清除效果最好,且改善胃黏膜炎癥效果良好;(2)頭花蓼可能通過(guò)調(diào)節(jié)模式識(shí)別受體TLR、DC-SIGN來(lái)影響固有免疫平衡;(3)頭花蓼可能具有調(diào)節(jié)胃腸激素GAS、SS平衡的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R259

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本文編號(hào)：2351383