【摘要】：本研究旨在篩選有效抑制牛源致病性大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)的蒙藥復方,并研究其抑菌作用機理和對感染致病性E. coli大鼠腸黏膜屏障的作用和機制,為蒙獸藥的開發(fā)鋪墊基礎,為獸用蒙藥復方的臨床推廣應用提供數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。本研究分為5個試驗,試驗1從奶牛直腸糞便中分離鑒定致病性E. coli,并進行了血清型分型、毒力基因和耐藥性檢測。試驗2針對致病性E. coli 01(含有eaeA、 stx1、hlyA和irp2等賦予菌株強致病性的4種毒力基因),通過體外抑菌、正交設計、體內抗菌和藥物加味試驗篩選了最佳抑菌蒙藥復方。試驗3研究了試驗2中篩選出的3種抑菌蒙藥復方對致病性E. coli O1的抑菌作用機理和抗菌譜。試驗4選取60只SD大鼠,分別為正常對照組、陰性對照組、陽性對照組、抑菌蒙藥復方Ⅲ高、中、低劑量組。除正常對照組外其余5組分別灌胃滅菌生理鹽水、0.13 g/kg環(huán)丙沙星、2.16 g/kg抑菌蒙藥復方ⅢK 1.08 g/kg抑菌蒙藥復方Ⅲ 0.54 g/kg抑菌蒙藥復方Ⅲ,連續(xù)7 d,2次/d,并于第五天末次給藥1h后腹腔注射80%最低致死量的E. coli O1。試驗結束后,采集樣品,進行腸黏膜屏障相關指標的檢測,研究了抑菌蒙藥復方Ⅲ對感染致病性E. coli O1大鼠腸黏膜屏障的作用機制。試驗5以RAW264.7細胞為巨噬細胞模型,采用MTT法測定抑菌蒙藥復方Ⅲ和E. coliO1對RAW264.7細胞的最適作用時間和濃度,并將試驗分為正常對照組、E. coli O1感染組、抑菌蒙藥復方Ⅲ組和抑菌蒙藥復方Ⅲ干預組,采用ELISA和試劑盒測定培養(yǎng)上清液中細胞因子、細胞存活率、ACP和LDH含量,探索了抑菌蒙藥復方Ⅲ對巨噬細胞活性和免疫功能的影響。研究結果如下：試驗1：從奶牛直腸采集的100份糞便樣品中分離鑒定出50株致病性E. coli,其中有24株菌分布于10種血清型,優(yōu)勢血清型為018、0146和0152；該50株致病性E. coli毒力基因的檢出率從高到低：irp2 eaeAstxl stx2 hlyA A,未檢出bfpA、st和lt；同時,10種血清型E.coli均對青霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、利福平、復方新諾明和阿莫西林等6種抗生素耐藥,表現(xiàn)為多重耐藥性。本研究中發(fā)現(xiàn),致病性E. coli O1致小鼠死亡時間最快、病變最明顯,并含有eaeA、stxl、hlyA和irp2等賦予菌株強致病性的4種毒力基因。因此,選取E. coli O1作為本研究的供試菌。試驗2：針對致病性E. coli O1,篩選出3種抑菌蒙藥復方,分別為朝您·哈日莫各、給喜古訥、阿如拉等7味蒙藥組成的抑菌蒙藥復方Ⅲ；古日古木、給喜古訥、阿如拉等5味蒙藥組成的抑菌蒙藥復方Ⅳ；當棍、渾欽、給喜古訥等7味蒙藥組成的抑菌蒙藥復方V。試驗3：3種抑菌蒙藥復方均能不同程度地抑制致病性E.coli O1,且對人工感染E. coli O1的小鼠有保護作用,其中抑菌蒙藥復方Ⅲ的保護率與環(huán)丙沙星相當,達到50%;3種抑菌蒙藥復方通過降低E. coli O1細胞表面疏水性、破壞細胞壁和細胞膜的完整性,使細胞內大分子物質外滲,抑制E. coli O1的蛋白表達,從而達到抑菌效果。此外,3種抑菌蒙藥復方有較廣的抑菌譜。試驗4：①與正常對照組相比,陰性對照組大鼠盲腸乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著降低(P0.05),抑菌蒙藥復方Ⅲ中劑量組的乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量無顯著性差異(P0.05)。②與空白對照組相比,陰性對照組回腸黏膜ITF含量顯著降低(P0.05),抑菌蒙藥復方Ⅲ中劑量組和陽性對照組的ITF含量無顯著性差異(P0.05)。③陰性對照組與空白對照組相比,大鼠小腸絨毛變短、水腫、斷裂脫落,絨毛長度、隱窩深度、V/C(絨毛長度／隱窩深度)值、肌層厚度均出現(xiàn)減小趨勢,TJ結構受損、DE異常、微絨毛紊亂變短,回腸黏膜OCCLUDIN？CLAUDIN-1和Z0-1蛋白含量和mRNA基因表達水平顯著下降(P0.05),血清DAO、D-乳酸和內毒素含量顯著增高(P0.05),并出現(xiàn)細菌移位現(xiàn)象。但抑菌蒙藥復方Ⅲ高、中劑量組和陽性對照組中上述情況均得到顯著的改善和修復。④陰性對照組與空白對照組相比,大鼠回腸黏膜sIgA、IL-2、IL-10、IFN-y和TGF-β1含量顯著降低(P0.05), IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量顯著提高(P0.05)；抑菌蒙藥復方Ⅲ高、中劑量組和陽性對照組與陰性對照組相比,大鼠回腸黏膜sIgA、IL-2、IL-10、 IFN-y和TGF-｛1含量顯著提高(P0.05), IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a含量顯著降低(P0.05)。由此可知,E. coli O1可破壞腸黏膜屏障(生物、化學、物理和免疫屏障),但高和中劑量的抑菌蒙藥復方Ⅲ能顯著改善和修復E. coli O1引起的大鼠腸黏膜屏障損傷,其中抑菌蒙藥復方Ⅲ中劑量的效果最佳。試驗5：抑菌蒙藥復方Ⅲ對RAW264.7細胞作用的最佳有效濃度為10-2g/mL,最佳作用時間為12h; E. coli O1對RAW264.7細胞的半數(shù)細胞毒性濃度為106CFU/mL,作用時間為2h; E.coli O1感染組測定的細胞因子含量均顯著提高(P0.05),細胞存活率顯著降低(P0.01),胞外LDH活力顯著提高(P0.01)胞內LDH和ACP含量顯著降低(P0.01)。抑菌蒙藥復方Ⅲ組IL-1β、IL-12、TNF-α. IFN-γ和IL-10顯著提高(P0.05),但其含量顯著低于E. coli O1感染組;抑菌蒙藥復方Ⅲ干預組與E. coli O1感染組相比,細胞因子含量均顯著降低(P0.05),細胞存活率顯著提高(P0.01),胞外LDH活力顯著降低(P0.01),胞內LDH和ACP顯著提高(P0.01)。由此可知,抑菌蒙藥復方111能夠提高巨噬細胞的吞噬和免疫功能,從而增強對入侵的致病性E. coli O1的吞噬和殺傷作用。
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【學位授予單位】：內蒙古農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R29
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本文編號：2297427