【摘要】：[研究目的]從整體水平,探討中藥筋脈通對STZ-DM大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織NADPH氧化酶p47phox亞基、NT及NGF表達的影響；從細胞水平,探討筋脈通含藥血清對高糖培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元NADPH氧化酶p47phox亞基、NT、NGF表達及細胞凋亡的影響。[研究方法]第一部分整體水平采用鏈脲佐菌素(STZ) 60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射SD大鼠的方法制造糖尿病模型。隨機數(shù)字表法將成模大鼠分為3組：糖尿病模型對照組(DM)、筋脈通治療組(JMT)及牛磺酸治療組(Tau),每組各10只。以體重、鼠齡相匹配的正常大鼠10只作為正常對照組(Con)。成模后予灌胃給藥,筋脈通組及�；撬峤M均按成人劑量15倍給藥,模型對照組和正常對照組灌服等量蒸溜水(1ml/100g/d)分別于治療前及治療后4周、8周、12周及16周檢測各組大鼠體重和血糖變化。所有實驗大鼠于灌胃16周后進行機械痛閾檢測后處死,取大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)組織。采用透射電子顯微鏡觀察DRG超微結(jié)構(gòu)變化,免疫組織化學(xué)染色法和Western blotting法檢測大鼠DRG組織中p47phox亞基、NT及NGF蛋白的表達,實時熒光定量PCR法檢測p47phox及NGF mRNA的表達。(因NT是酪氨酸硝基化產(chǎn)物,沒有直接編碼的mRNA,所以沒有進行PCR檢測)第二部分細胞水平1.含藥血清的制備：雄性SD大鼠隨機分為3組,灌胃蒸餾水(20只)制備正常血清；按成人劑量15倍給藥灌胃筋脈通(10只)、�；撬�(10只)制備含藥血清。灌胃時間均為1周。2.胎鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的制備：取孕15天(E15)的SD胎鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRGn),采用混合酶分步消化法、Neurobasal無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基+B27添加劑+NGF培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng),經(jīng)密度梯度離心法、差速貼壁法進行細胞純化,抗MAP-2抗體進行細胞鑒定。3.根據(jù)課題組近期研究結(jié)果,確定實驗組分為4組：正常對照組(Con)、高糖組(HG,45mmol/L葡萄糖)、筋脈通組(JMT)、�；撬峤M(Tau)。最佳干預(yù)時間點為貼壁后24小時,后續(xù)指標(biāo)檢測時間點為干預(yù)后24小時,含藥血清添加濃度均為10%。CCK-8法檢測細胞活性,TUNEL法檢測細胞凋亡。在既往課題組研究結(jié)果——筋脈通含藥血清能抑制高糖培養(yǎng)背根神經(jīng)元活性氧簇(ROS)的基礎(chǔ)上,用免疫熒光細胞化學(xué)法、Western blotting法檢測DRGn中NADPH氧化酶p47phox亞基、NT及NGF蛋白的表達,qRT-PCR法檢測p47phox亞基及NGF mRNA的表達。[研究結(jié)果]第一部分整體水平1.血糖和體重：各造模組大鼠血糖與Con組相比均升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)；各治療組血糖在同一時間點與DM組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P均0.05)干預(yù)前后,同一時間點各治療組大鼠之間的體重?zé)o明顯差異(P均0.05)。給藥4、8、12、16周各造模組與Con組相比體重下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。2.機械痛閾值：與Con組相比,DM組左、右兩側(cè)機械痛閾均顯著降低(P0.01)；與DM組比較,JMT組及Tau組兩治療組左側(cè)機械痛閾提高(P0.05),右側(cè)機械痛閾顯著提高(P0.01)；兩治療組間比較,左、右兩側(cè)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.透射電鏡觀察背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)的變化：Con組大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)細胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)完整清晰,線粒體含量豐富且結(jié)構(gòu)正常,核膜較規(guī)整。DM組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重度損傷,線粒體腫脹變性,線粒體嵴斷裂、減少甚至消失,大部分呈空泡樣變。JMT組及Tau組細胞超微結(jié)構(gòu)破壞程度較DM組減輕。4.DRG組織中NADPH氧化酶p47phox亞基、NT及NGF蛋白及mRNA表達結(jié)果的比較：①免疫組化法結(jié)果顯示：與Con組比較,DM組p47phox亞基、NT表達顯著升高,NGF表達顯著降低(P0.01)。與DM組比較,JMT組p47phox亞基表達降低、兩治療組NT表達均顯著下降,NGF的表達量顯著升高(P0.01)。與Tau組比較,JMT組NT表達降低,NGF表達顯著升高(P0.05或P0.01)。②Western blotting結(jié)果顯示：與Con組比較,DM組p47phox亞基、NT蛋白表達顯著升高,NGF蛋白表達顯著降低(P0.01)。與DM組比較,兩治療組p47phox亞基、NT蛋白表達顯著下降,NGF的表達顯著升高(P0.01)。與Tau組比較,JMT組NGF蛋白表達量升高,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),p47phox亞基及NT蛋白表達無差異(P0.05)。③qRT-PCR結(jié)果顯示：與Con組比較,DM組p47phox亞基mRNA表達量顯著升高,NGF顯著降低(P0.01)。與DM組比較,兩治療組p47phox亞基mRNA表達量顯著下降,JMT組NGF mRNA的表達量升高(P0.01或P0.05)。兩治療組比較,p47phox亞基及NGF mRNA表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。第二部分細胞水平1 .DRGn細胞調(diào)亡率：與Con組比較,HG組的細胞調(diào)亡率顯著升高(P0.01)；與HG組比較,JMT組和Tau組的細胞調(diào)亡率均顯著降低(P0.01),JMT組和Tau組的細胞調(diào)亡率與Con組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；JMT組與Tau組之間比較,細胞調(diào)亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.透射電鏡觀察各組DRGn超微結(jié)構(gòu)：與整體部分結(jié)果相似,Con組DRGn形態(tài)完整清晰,線粒體含量豐富且結(jié)構(gòu)正常,核膜較完整。HG組DRGn出現(xiàn)明顯損傷,線粒體腫脹變性,線粒體外膜破壞,線粒體嵴斷裂、減少甚至消失,大部分呈空泡樣變。JMT組及Tau組DRGn超微結(jié)構(gòu)病變程度較DM組減輕。3. DRGn細胞中p47phox亞基、NT及NGF蛋白及mRNA表達結(jié)果的比較：①免疫熒光細胞化學(xué)法結(jié)果顯示：與Con組比較,HG組p47phox亞基、NT表達顯著升高,NGF表達顯著降低(P0.01)。與HG組比較,兩治療組p47phox亞基及NT的表達均顯著降低、NGF的表達均顯著升高(P0.01)。與Tau組比較,JMT組NGF表達升高,具有統(tǒng)計意義(P0.05); P47phox亞基及NT的表達無差異(P0.05)。②Western blotting結(jié)果顯示：與Con組比較,HG組p47phox亞基、NT蛋白表達顯著升高(P0.01), NGF蛋白表達顯著降低(P0.01)。與HG組比較,兩治療組p47phox亞基、NT蛋白表達顯著下降(P0.01),JMT組NGF的表達顯著升高(P0.01), Tau組無差異(P0.05)。與Tau組比較,JMT組NGF蛋白表達顯著升高(P0.01), P47phox亞基及NT蛋白表達無差異(P0.05)③qRT-PCR結(jié)果顯示：與Con組比較,HG組p47Phox亞基mRNA表達顯著升高,NGF mRNA表達降低或顯著降低(P0.01或P0.05)。與HG組比較,兩治療組p47phox亞基mRNA表達顯著下降,NGF的表達顯著升高(P0.01)。兩治療組比較,p47Phox亞基及NGF mRNA的表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。[結(jié)論]第一部分整體水平1.空腹一次性腹腔注射STZ 60mg/kg 72小時后檢測血糖值大于16.7mmol/L為造模成功。16周后DM大鼠出現(xiàn)痛覺過敏,提示感覺神經(jīng)受累,DPN造模成功。DPN大鼠DRG細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)嚴重損傷。2.DPN大鼠背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)損傷,線粒體嵴腫脹,嵴斷裂,甚至空泡樣變。DRG組織中p47Phox亞基、NT蛋白及mRNA的表達顯著升高,NGF蛋白及mRNA的表達顯著降低。3.筋脈通可改善DPN大鼠痛覺過敏,減輕超微結(jié)構(gòu)損傷,下調(diào)p47phox亞基及NT蛋白及mRNA的表達,上調(diào)NGF蛋白及mRNA的表達,免疫組化結(jié)果顯示,中藥筋脈通降低NT及升高NGF蛋白表達的作用優(yōu)于對照藥牛磺酸。第二部分細胞水平1.高糖可顯著抑制DRGn細胞活性,高糖培養(yǎng)DRGn細胞凋亡率顯著升高,細胞超微結(jié)構(gòu)破壞,線粒體損傷明顯。高糖培養(yǎng)DRGn細胞p47phox亞基和NT蛋白及mRNA的表達顯著升高,NGF蛋白及mRNA的表達顯著下降。2.筋脈通含藥血清可提高高糖培養(yǎng)DRGn細胞活性,降低細胞凋亡率,減輕超微結(jié)構(gòu)損傷,下調(diào)高糖培養(yǎng)DRGn p47phox亞基及NT蛋白及mRNA的表達,上調(diào)NGF蛋白及mRNA的表達,免疫熒光及Western blotting結(jié)果顯示,筋脈通含藥血清升高NGF蛋白表達的作用優(yōu)于對照藥�；撬�。[創(chuàng)新點]本實驗從整體和細胞水平觀察中藥筋脈通同時對STZ-DM大鼠背根神經(jīng)節(jié)及高糖培養(yǎng)背根神經(jīng)元氧化及硝化應(yīng)激,以及神經(jīng)生長因子的影響,目前未見相同的報道。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R259

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本文編號：2286197