【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)在眼部的主要并發(fā)癥是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR),它作為一種不可逆盲,嚴(yán)重威脅患者的視功能。因DR發(fā)病機制復(fù)雜,目前尚未闡明。隨著對DR研究的不斷深入,人們認(rèn)識到DR是一種神經(jīng)血管性疾病,且神經(jīng)組織的損傷可能早于微血管病理改變。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是參與DM視網(wǎng)膜神經(jīng)組織損傷發(fā)病過程的重要事件。自殺相關(guān)因子(factors associated suicide,fas)和半胱天冬酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8,caspase-8)是細(xì)胞凋亡中死亡受體途徑中重要的靶標(biāo)因子,共同參與細(xì)胞凋亡。菩人丹(Purendan superfine powder,PRD)是以苦瓜為君藥,丹參、人參為臣藥,葛根、何首烏及水蛭為佐使藥,六味藥共同組成的中藥復(fù)方。本研究旨在觀察PRD對Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty(OLETF)大鼠視網(wǎng)膜fas和caspase-8表達(dá)的影響,為臨床可能應(yīng)用中藥復(fù)方制劑PRD治療DM視網(wǎng)膜神經(jīng)組織損傷提供理論依據(jù)。目的:觀察中藥復(fù)方PRD對OLETF大鼠視網(wǎng)膜中fas和caspase-8表達(dá)的影響,探討PRD對DM大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)組織可能的保護作用。方法:1以雄性自發(fā)性2型DM大鼠模型OLETF大鼠和非DM對照組LETO大鼠為實驗對象,以血糖峰值16.7 mmol/L和負(fù)荷后120 min血糖11.1mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后,將24只成模的OLETF大鼠隨機分為PRD治療組和DM模型組,每組各12只;同周齡12只雄性LETO大鼠為正常對照組。PRD治療組大鼠連續(xù)PRD(1.8 g超微粉/kg/d)灌胃2個月,正常對照組和DM模型組給予等量蒸餾水灌胃。2蘇木素-伊紅染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。3 TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況。4sp免疫組織化學(xué)染色法及免疫印跡法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜fas和caspase-8表達(dá)的蛋白。5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)的方法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜中fas和caspase-8mrna的表達(dá)。結(jié)果:1各組大鼠視網(wǎng)膜組織的病理改變正常組:高倍光鏡下可見視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整、排列整齊,細(xì)胞大小均勻,內(nèi)界膜完整。模型組:視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次欠清楚,視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells,rgcs)排列紊亂,數(shù)量減少,有空泡樣改變,并可見核固縮及部分核溶解,內(nèi)界膜腫脹增厚、粗糙不平,可見部分內(nèi)界膜破裂。prd組:視網(wǎng)膜的層次清楚,rgcs排列輕度紊亂,數(shù)量稍減少,內(nèi)界膜表面腫脹增厚減輕,粗糙稍欠平。2tunel法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡結(jié)果陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕褐色、顆粒狀,位于胞核中,在各組大鼠視網(wǎng)膜切片均可見。陽性細(xì)胞散在分布于內(nèi)核層和rgcs層。與正常對照組相比,dm組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的ai顯著升高(p0.01);與dm組比較,prd治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的ai明顯降低(p0.01)。3fas蛋白及mrna在各組大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示,fas的陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色、細(xì)顆粒狀,位于胞質(zhì)中。免疫陽性細(xì)胞主要分布部位為內(nèi)核層和rgcs層。與正常對照組相比,dm組大鼠視網(wǎng)膜fas蛋白及mrna表達(dá)顯著升高(p0.01);與dm組比較,prd治療組大鼠視網(wǎng)膜fas蛋白及mrna表達(dá)顯著降低(p0.01)。4caspase-8蛋白及mrna在各組大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示,caspase-8的陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為棕黃色、細(xì)顆粒狀,位于胞質(zhì)中。免疫陽性細(xì)胞主要分布部位為內(nèi)核層和rgcs層。與正常對照組相比,dm組大鼠的視網(wǎng)膜caspase-8蛋白及mrna顯著升高(p0.01);與dm組相比,prd治療組大鼠的視網(wǎng)膜caspase-8蛋白及mrna顯著降低(p0.01)。結(jié)論:1prd可抑制fas、caspase-8蛋白及mrna在糖尿病視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。2 PRD對DR有保護作用,其機制可能是通過抑制fas及caspase-8蛋白及mRNA的表達(dá),減少糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。
[Abstract]:The main complication of diabetes mellitus (DM) in the eye is diabetic retinopathy (DR). As an irreversible blindness, DR seriously threatens the visual function of the patients. The pathogenesis of DR is complex and has not been elucidated yet. With the deepening of the study of DR, people realize that DR is a neurovascular disease, and DR is an irreversible blindness. Apoptosis is an important event involved in the pathogenesis of retinal nerve injury in DM. Suicide-associated factors (fas) and cysteine aspartate acid specific protease-8 (caspase-8) are death receptors in apoptosis. Purendan superfine powder (PRD) is a Chinese herbal compound consisting of balsam pear, Salvia miltiorrhiza, ginseng, kudzu root, Polygonum multiflorum and leech as adjuvant and six kinds of herbs. The aim of this study was to observe the effect of PRD on Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rat retina. Objective: To observe the effect of PRD on the expression of Fas and caspase-8 in the retina of OLETF rats and explore the possible protective effect of PRD on the retinal nerve tissue of DM rats. Twenty-four OLETF rats were randomly divided into PRD treatment group and DM model group with 12 rats in each group and 12 male LETO rats at the same age as normal control group. Rats in the PRD treatment group were given PRD (1.8 g ultrafine powder/kg/d) for 2 months. Rats in the normal control group and DM model group were given the same amount of distilled water. 2 Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphological changes of retina in each group. 3 TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) was used to detect the apoptosis of retinal neurons in each group. Immunohistochemical staining and Western blotting were used to detect the expression of Fas and caspase-8 in the retina of rats in each group. the expression of Fas and caspase-8 mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (rt-pcr). In model group, the retinal structure was not clear, the retinal ganglion cells (rgcs) were disorderly arranged, the number of RGCs was reduced, vacuole-like changes were observed, nucleus shrinkage and partial nucleolysis were observed, the inner limiting membrane was swelling and thickening, rough and uneven, and part of the inner limiting membrane ruptured. Rd group: the retinal layers were clear, RGCs were slightly disordered, the number of RGCs was slightly reduced, the swelling and thickening of the inner limiting membrane was alleviated, rough and slightly uneven. 2 TUNEL assay showed that the positive products of retinal cell apoptosis were brown, granular, located in the nucleus of the retina. the positive cells were scattered in the inner nuclear layer and R section of the retina. Compared with the normal control group, AI of retinal nerve cells in DM group increased significantly (p0.01); compared with DM group, AI of retinal nerve cells in PRD group decreased significantly (p0.01). 3 Fas protein and mRNA expression in the retina of rats in each group showed that the positive products of Fas were brown yellow, fine granular. Compared with the normal control group, the expression of Fas protein and mRNA in the retina of DM group increased significantly (p0.01); compared with the DM group, the expression of Fas protein and mRNA in the retina of PRD group decreased significantly (p0.01). 4 caspase-8 protein and mRNA in the retina of rats in each group were significantly lower (p0.01). Immunohistochemical staining showed that the positive products of caspase-8 were brown-yellow, fine granular and located in the cytoplasm. CONCLUSION: 1prd can inhibit the expression of fas, caspase-8 protein and mRNA in diabetic retina. 2PRD can protect DR by inhibiting the expression of fas, caspase-8 protein and mRNA and reducing the apoptosis of diabetic retinal neurons.
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R276.7

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本文編號：2211992