發(fā)布時(shí)間：2018-07-03 12:04

  本文選題：電針 + HepG2荷瘤裸鼠�。� 參考：《成都中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：本研究旨在以表里經(jīng)配穴理論為指導(dǎo)依據(jù),選取足三里和三陰交穴,使用HepG2荷瘤裸鼠模型為載體,進(jìn)行電針控瘤干預(yù)。以miRNA芯片表達(dá)譜篩選的miR-409-5p為立足點(diǎn),將腫瘤發(fā)生發(fā)展及免疫抑制微環(huán)境中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)TGF-β1定為靶基因,使用生物信息學(xué)方法構(gòu)建“miR-409-5p靶向抑制TGF-β1”的研究主線。運(yùn)用miRNA mimics 及 antagomir等生物學(xué)技術(shù),從體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面,驗(yàn)證電針控瘤效應(yīng)的miR-409-5p靶向抑制TGF-β1分子調(diào)控機(jī)制。以期從基因?qū)用嫣剿麟娽樛ㄟ^延緩荷瘤生長(zhǎng)速度,發(fā)揮控瘤效應(yīng)的作用原理,為針灸作為腫瘤“帶瘤生存期”維持階段的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法：本研究主要從電針對(duì)HepG2荷瘤裸鼠的控瘤效應(yīng)觀測(cè)、miR-409-5p表達(dá)譜篩選及靶基因TGF-β1預(yù)測(cè)和驗(yàn)證、電針控瘤效應(yīng)的miR-409-5p靶向抑制TGF-β1分子調(diào)控機(jī)制研究三個(gè)方面開展實(shí)驗(yàn)工作,并分五個(gè)步驟進(jìn)行實(shí)施：1.將32只裸鼠隨機(jī)分為電針組、電刺激組、模型組與空白組,每組8只動(dòng)物。建立HepG2荷瘤裸鼠模型,采用電針操作,對(duì)裸鼠雙下肢“足三里+三陰交”穴進(jìn)行干預(yù)(30 min/天,10天/1療程),觀測(cè)電針的控瘤效應(yīng)。2.通過LC Sciences高通量寡核苷酸miRNA芯片,在干預(yù)結(jié)束后對(duì)電針組和模型組的裸鼠荷瘤組織進(jìn)行基因表達(dá)譜檢測(cè),篩選出組間差異表達(dá)的miRNAs,并對(duì)可能有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值的,miR-409-5p吏用qRT-PCR技術(shù),擴(kuò)大樣本驗(yàn)證芯片結(jié)果。3.通過LC Sciences公司采用TargetScan、PicTar 及 miRanda數(shù)據(jù)庫的相應(yīng)算法進(jìn)行預(yù)測(cè),獲得差異表達(dá)miRN As對(duì)應(yīng)的所有靶基因；參考GO及KEGG富集性分析等方法,并通過查找相關(guān)資料和最新文獻(xiàn),篩選出具備顯著臨床病理特征的靶基因,建立具有研究?jī)r(jià)值的miRN As-KEGG-network的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)表；從中將在腫瘤發(fā)生發(fā)展及免疫抑制微環(huán)境中起重要作用的TGF-β1定為繼續(xù)探索的靶基因。4.通過MTT法和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-409-5pmimics對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和遷移的影響,并檢測(cè)其對(duì)靶基因TGF-β1表達(dá)量的影響。5.采用microOFFTM antagomir-409-5p瘤內(nèi)定點(diǎn)注射技術(shù),封閉miR-409-5p功能。將32只裸鼠隨機(jī)分為電針+antagomir Ncontrol組、電針+antagomir-409-5p組、模型組與空白組,每組8只動(dòng)物。觀測(cè)各組的控瘤效應(yīng),裸鼠血清TGF-β1含量,并用免疫組化法檢測(cè)荷瘤組織的TGF-β1及PCNA表達(dá)。結(jié)果：1.瘤重比和腫瘤生長(zhǎng)抑制率等觀測(cè)結(jié)果顯示,電針組優(yōu)于模型組和電刺激組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；電針組裸鼠荷瘤生長(zhǎng)速度較其余兩組相對(duì)緩慢。2.差異表達(dá)的miRNAs篩選結(jié)果,以P值0.05為上限,分析得到14個(gè)差異表達(dá)的miRN As基因,其中10個(gè)差異基閃為上調(diào)表達(dá),4個(gè)為下調(diào)表達(dá)。以P值≤0.01為上限僅篩選得到呈上調(diào)表達(dá)的miR-409-5p。對(duì)miR-409-5p進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,電針組擴(kuò)增倍數(shù)為1.00,模型組為0.24,組間存在倍數(shù)差異,電針組miR-409-5p表達(dá)與芯片篩選結(jié)果一致。3.使用TargetScan等3個(gè)數(shù)據(jù)庫的算法計(jì)算,再通過GO和KEGG等生物信息分析,均預(yù)測(cè)到靶基因TGF-β1和：niR-409-5p相關(guān)通路有關(guān)聯(lián)性。TGF-β1是腫瘤發(fā)生發(fā)展和免疫抑制微環(huán)境中關(guān)鍵的細(xì)胞因子及通路環(huán)節(jié),與本課題電針延緩荷瘤生長(zhǎng)速度,發(fā)揮控瘤效應(yīng)的機(jī)制可能密切相關(guān),故從生物信息學(xué)層而初步構(gòu)建miR-409-5p—TGF-β1通路功能圖。4.MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-409-5p在HepG2細(xì)胞的過表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖,并且調(diào)控能力隨miR-409-5pmimics濃度的提高和時(shí)間增長(zhǎng)成正比關(guān)系。劃痕實(shí)驗(yàn)證明,過表達(dá)miR-409-5p mimics的腫瘤細(xì)胞體外遷移能力明顯低于NC mimics組,miR-409-5p在HepG2細(xì)胞的過表達(dá)也可以降低細(xì)胞體外遷移能力。進(jìn)行qRT-PCR操作,證明miR-409-5pmimicsTGF-β1表達(dá)水平有顯著影響。5.瘤重比和腫瘤生長(zhǎng)抑制率等控瘤效應(yīng)指標(biāo)結(jié)果顯示,電針+antagomir N control組優(yōu)于電針+antagomir-409-5p組,電針+antagomir-409-5p組優(yōu)于模型組,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；荷瘤生長(zhǎng)速度比較,電針+antagomirNcontrol組相對(duì)較緩,電針+antagomir-409-5p組次之。在腫瘤組織TGF-β1表達(dá)水平上,也出現(xiàn)同樣的規(guī)律,以電針+antagomir Ncontrol組最低,電針+antagomir-409-5p組次之,模型組最高的梯狀下降分布,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。雖然在血清TGF-β1含量和腫瘤組織PCNA表達(dá)水平指標(biāo),電針+antagomir Ncontrol組與電針+antagomir-409-5p組均優(yōu)于模型組(P0.05),但兩組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.電針可以一定程度的延緩荷瘤生長(zhǎng)趨勢(shì),但目前僅能證明在HegG2癌細(xì)胞株上有作用,還需要選擇不同的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行研究。并且本研究觀測(cè)得到的生長(zhǎng)趨勢(shì)有延緩變化的結(jié)果,僅體現(xiàn)在實(shí)施干預(yù)的這一段時(shí)間里,在將來的研究中,需對(duì)針灸后效應(yīng)和電針對(duì)荷瘤裸鼠生存時(shí)間的影響進(jìn)行深入探討。2. miR-409-5p皂抑制HepG2細(xì)胞的增殖和遷移,并下調(diào)TGF-β1的表達(dá)。3.電針控瘤效應(yīng)與miR-409-5p靶向抑制TGF-β1分子調(diào)控通路可能有相關(guān)性。電針控瘤效應(yīng)的具體作用環(huán)節(jié)肯定還有其它niRNAs和靶基因參與其中,但本研究選擇的靶基因TGF-β1是非常重要的細(xì)胞因子,從多個(gè)因素影響腫瘤內(nèi)環(huán)境,能觀測(cè)的效應(yīng)變化才如此顯著,但還需要進(jìn)行多次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。
[Abstract]:Objective : To study the expression profile of miR - 409 - 5p in nude mice .
The target gene with significant clinical and pathological characteristics was screened through searching relevant data and the latest literatures , and the network association table of miRN As - KEGGS - network with the research value was established .
TGF - 尾1 , which plays an important role in tumor development and immune suppression , was identified as the target gene for continued exploration . The effects of miR - 409 - 5pounce on proliferation and migration of HepG2 cells were detected by MTT and scratch test .
The expression of miR - 409 - 5p in HepG2 cells was significantly lower than that in NC group . The results showed that the expression of miR - 409 - 5p in HepG2 cells was significantly lower than that in NC group .
There was no significant difference in TGF - 尾1 expression in tumor tissues ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R245.97

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