本文選題：高血壓 + 性別差異�。� 參考：《中國中醫(yī)科學院》2016年博士論文

【摘要】：課題組前期將雌雄不同性別供體C57小鼠來源的CD3+T細胞分別移植入雄性Rag-1-/- (Recombination activating gene-1 knocked)小鼠體內,給予AngⅡ (AngiotensinⅡ,血管緊張素II)干預后,發(fā)現(xiàn)雄性Rag-1-/-小鼠在給予雄性CD3+T細胞移植后(CD3M→Rag-1-1--M)血壓較雄性Rag-1-/-小鼠在給予雌性CD3+T細胞移植后(CD3F→Rag-1-/--M)高,且與CDF→Rag-1-/--M比較,CD3M→Rag-1-/--M血漿及腎臟內IL-17A(Interlukin-17A,白細胞介素-17A)及TNF-α (Tumor necrosis factor-α,腫瘤壞死因子α)前炎癥因子水平較高,而IL-10(Interlukin-10,白細胞介素-10)這一保護因子水平CD3F→Rag-1-1--M比CD3M→Rag-1-/--M高,從而證實：供體的性激素及性染色體類型對T細胞分化的影響是導致受體接受T細胞移植后,針對AngⅡ作用血壓高低差異的原因。高血壓的性別差異與T細胞分化之間的關系究竟與性激素還是性染色體更為密切?本課題組與其他課題組合作又進行了進一步驗證。將供體雄性C57小鼠的CD3+T細胞分別移植給雌雄不同性別的受體Rag-1/-/-小鼠,給予AngⅡ干預后,發(fā)現(xiàn)給予雄性CD3+T細胞移植后的雄性Rag-1-/-小鼠(CD3M→Rag-1/-/--M)的血壓要明顯高于給予雄性CD3+T細胞移植后的雌性Rag-1-/-小鼠(CD3M→Rag-1-/--F)的血壓,從而證實：受體的性別,即受體產生的主要性激素的類型的差異是導致高血壓性別差異的原因,其中,雌激素有對抗高血壓的作用。為進一步研究性激素及性染色體在高血壓的性別差異中各自的作用及性別差異對高血壓T細胞分化的影響。課題組現(xiàn)建立Rag-1-/-小鼠植入C57小鼠骨髓細胞的骨髓移植模型。將雌雄不同性別供體C57小鼠來源的骨髓細胞分別移植入雄性Rag-1-/-小鼠體內,并給予AngⅡ干預,觀察雄性Rag-1-/-小鼠在給予雄性骨髓細胞移植后(BMM→Rag-1-/--M)與雄性Rag-1-/-小鼠在給予雌性骨髓細胞移植后(BMF→Rag-1-/--M)兩者血壓及心率的差異,檢測全血及小鼠脾細胞中T細胞亞型的分化情況。課題組又建立去勢的雌、雄SHR (spontaneously hypertensive rats,自發(fā)型高血壓大鼠)模型,皆給予補充外源性雌、雄激素,觀察性激素與性染色體對高血壓的影響；通過檢測外周血及脾細胞中T細胞亞型的分化情況,探索高血壓性別差異與T細胞免疫之間的關系；同時,觀察淫羊藿苷調節(jié)血壓的類性激素作用,探索其對高血壓T細胞分化的影響。本研究將為植物類性激素應用于臨床調節(jié)不同性別患者血壓提供一定實驗依據(jù)。本課題研究分為兩部分：文獻綜述和實驗研究。1.文獻綜述：本部分從性激素與高血壓、高血壓性別差異與T細胞免疫研究進展、淫羊藿苷的心血管保護作用及機制研究進展三個方面進行綜述。2.實驗研究：包括以下三個部分。研究一Rag-1-/-小鼠骨髓移植輻射劑量確定及骨髓移植成功率檢測目的：探索受體Rag-1-/-小鼠骨髓移植輻射劑量,并通過流式細胞術檢測受體Rag-1-/-小鼠在植入供體B6小鼠骨髓細胞后B6小鼠骨髓細胞所占比例,鑒定骨髓移植手術是否成功。為后續(xù)研究提供較為成熟的骨髓移植模型。方法：選取骨髓細胞(bone marrow cells,BM)表面表達CD90.2(即CD90.2+)的具有免疫缺陷的Rag-1-/-小鼠做受體,骨髓細胞表面表達CD90.1(即CD90.1+)的雄性B6小鼠作為供體,在Rag-1-/-小鼠接受500rads或800rads伽馬射線照射干預后,將B6小鼠骨髓細胞分離提取,并以5×107個細胞／只的劑量經眼球后靜脈叢注入Rag-1-/-小鼠體內形成B6-BM→Rag1-/-復合體小鼠。三周后,通過流式細胞儀檢測復合體小鼠外周血由骨髓細胞分化而來的外周單個核細胞表面CD90.1表達比例,推測骨髓移植成功與否。結果：①Rag-1-/-小鼠在給予500rads襯線照射后,無論是否給予B6小鼠骨髓移植,都能夠健康存活至照射后50天,體重逐漸增加。而給予800rads照射的Rag-1-/-小鼠,未給予骨髓移植(Rag-1-/--M+800rads組),則小鼠在照射后三周內體重驟然降低,陸續(xù)死亡；而給予B6小鼠骨髓移植的Rag-1-/-小鼠(BMM→Rag-1-/-M +800rads)卻能夠健康存活達射線照射后的50天,體重逐漸增加。②流式細胞檢測結果表明,Rag-1-/-小鼠外周血單個核細胞表面主要表達CD90.2(96.12±0.83%)。B6小鼠單個核細胞表面主要表達CD90.1(98.85±1.04%)。當用500rads的射線照射Rag-1-/-小鼠并給予B6小鼠骨髓細胞移植,骨髓分化而來的單個核細胞表而CD90.1的比例只有49.7±0.97%,而CD90.2的比例也只有50.3±1.11%。當用800rads射線照射Rag-1-/-小鼠并給予B6小鼠骨髓細胞移植,則檢測由骨髓分化來的單個核細胞表面CD90.1表達可達93.16±1.53%,大于90%。結論：800rads伽馬射線照射Rag-1-/-小鼠能夠不可逆的損傷其骨髓細胞,給予照射后的Rag-1-/-小鼠接受來自供體B6小鼠5×107個骨髓細胞移植后,供體B6小鼠骨髓細胞替代比例達90%以上。骨髓移植模型成功。研究二高血壓鼠性別差異與T細胞免疫調節(jié)的關系的研究目的：研究性染色體在高血壓性別差異中的作用,及雌雄性染色體差異對T細胞分化的影響。方法：給予受體雄性Rag-1-/-小鼠800rads伽馬射線照射并分別植入雌、雄(M orF)不同性別供體C57小鼠的骨髓細胞建立BMM→Rag-1-/--M及BMF→Rag-1--/-M復合體模型。通過皮下植入AngⅡ緩釋泵,給予兩種復合體小鼠AngⅡ干預后,觀察雄性Rag-1-/-小鼠在植入具有雌、雄不同性染色體的骨髓細胞后,兩類復合體小鼠生存時間、體重、血壓、心率的差異。同時,應用流式細胞術檢測具有雌、雄不同性染色體的骨髓細胞在移植入同一性激素內環(huán)境下分化的外周血及脾細胞中T細胞分化亞型的情況。結果：①與未行射線干預的Rag-1/-/--M組小鼠相比,BMF→Rag-1-/--M +800rads組及BMM→Rag-1-/--M+800rads組小鼠皆能健康存活至骨髓移植后54天。而給予800rads射線照射而未給予骨髓移植的Rag-1-/--M+800rads組小鼠在接受輻射后23天內相繼死去。②骨髓移植術后,與BMF→Rag-1-/--M+800rads組相比BMM→Rag-1-/--M+800rads組小鼠體重明顯增加(P0.01)。③在AngⅡ干預后,BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠血壓明顯高于BMM→Rag-1-/--M+800rads組(P0.01)。④在AngⅡ干預后,BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠心率明顯快于BMM→Rag-1-/--M+800rads組(P0.01)。⑤小鼠外周血T細胞亞型差異比較：在給予AngⅡ干預后,BMM→Rag-1-/--M +800rads組與BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠外周血Tc(Cytotoxic T lymphocytes,殺傷T細胞)及Th(T helper lymphocytes,輔助T淋巴細胞)比例無明顯差異(P0.05)；而與BMM→Rag-1-/--M+800rads組相比,BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠外周血Th17 (Thelp 17 lymphocytes,輔助T17淋巴細胞)比例明顯增加(P0.01)；與BMM→Rag-1-/--M+800rads組相比,BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠外周血Tregs (regulatory T cells,調節(jié)T細胞)細胞比例有增加的趨勢(P0.05)。⑥小鼠脾細胞中T細胞亞型差異比較：在給予AngⅡ干預后,BMM→Rag-1-/--M +800rads組與BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠脾細胞中Tc細胞及Th細胞比例無明顯差異(P0.05)；與BMM→Rag-1-/--M+800rads組相比,BMF→Rag-1-/--M +800rads組小鼠脾細胞中Th17細胞比例明顯增加(P0.01)；與BMM→Rag-1-/--M +800rads組相比,BMF→Rag-1-/--M+800rads組小鼠脾細胞Tregs細胞比例無明顯差異(P0.05)。結論：性染色體差異是除性激素外另一個導致高血壓性別差異的因素。在性激素類型相同的條件下,與雄性性染色體相比,雌性性染色體的存在能夠升高T細胞亞型中Th17細胞亞型的分化比例,從而使個體針對AngⅡ產生較高的血壓。研究三淫羊藿苷對自發(fā)型高血壓大鼠血壓調節(jié)的類性激素效應及機制研究目的：觀察外源性性激素及本身性染色體對去勢SHR大鼠血壓、心率、外周血及脾細胞中T細胞亞型分化的影響。同時探索淫羊藿苷對去勢SHR大鼠血壓調節(jié)的類性激素作用,并研究其作用機制。方法：給予雄性SHR大鼠睪丸切除術及給予雌性SHR大鼠卵巢切除術建立雌雄去勢高血壓模型。分別給予雌、雄去勢高血壓大鼠雌二醇、睪酮及高低劑量的淫羊藿苷,雌雄激素受體抑制劑等藥物干預,將去勢雄性實驗用鼠共分為以7個組：對照組(WKY-M組),模型組(SHR-M),雌二醇組(SHR-E2-M, E2:0.1mg/kg/day),睪酮組(SHR-T-M, T:26mg/kg/month),淫羊藿苷低劑量組(SHR-I-M, Icariin: 20mg/kg/day),淫羊藿苷高劑量組(SHR-HI-M, Icariin:40mg/kg/day).淫羊藿苷高劑量+雄激素受體抑制劑組(SHR-HI+Flu-M, Icariin:40mg/kg/day, Flutamide: 22.3mg/kg/8 hours)。將去勢雌性實驗用鼠共分為以下7個組：對照組(WKY-F組),模型組(SHR-F),雌二醇組(SHR-E2-F, E2:0.1 mg/kg/day),睪酮組(SHR-T-F, T:26mg/kg/month),淫羊藿苷低劑量組(SHR-I-F, Icariin:20mg/kg/day),淫羊藿苷高劑量組(SHR-HI-F, Icariin:40mg/kg/day).淫羊藿苷高劑量+雌激素受體抑制劑組(SHR-HI+ICI-F,Icariin:40mg/kg/day, Fulvestrant/ICI 182780: 52mg/kg/month)。定期檢測各組大鼠體重、血壓、心率變化。給藥6周后處死大鼠,取大鼠脾臟、心臟、左右腎臟、及子宮(雌性),計算大鼠各臟器系數(shù)。取抗凝血用于外周血單個核細胞中T細胞亞型Tc、Th、Tregs分化比例的流式細胞檢測。分離脾細胞用于脾細胞中T細胞亞型Tc、Th、Tregs分化比例的流式細胞檢測。取促凝血用于大鼠血清中雌二醇、睪酮、AngⅡ、TNF-α、IL-17水平的檢測Elisa指標檢測。分離主動脈用于主動脈的HE染色及Masson染色,同時也用于主動脈ERβ(estrogen receptor beta,雌激素受體p)及AR (androgen receptor,雄激素受體)蛋白表達的Western-blot檢測。結果：①給予睪酮干預后,雄性SHR大鼠體重明顯增加(P0.01)。給予雌二醇干預后,雌性SHR大鼠體重明顯降低(P0.01)。給予淫羊藿苷干預,雌雄去勢SHR大鼠體重無明顯變化(P0.05)。②給予雌二醇、淫羊藿苷都能夠使去勢的雄性SHR大鼠血壓降低(P0.01),而給予睪酮卻能使血壓升高(P0.01)。給予雌二醇及淫羊藿苷能夠使去勢雌性SHR大鼠血壓降低(P0.01),而給予睪酮卻能夠使血壓升高(P0.01)；且淫羊藿苷這種作用能夠被雌激素受體拮抗劑所阻斷(P0.01)。③給予去勢雄性SHR大鼠睪酮及淫羊藿苷高劑量干預能夠明顯降低其心率(P0.01),而雌二醇對心率無明顯影響(P0.05)。淫羊藿苷高劑量的作用能夠被雄激素受體拮抗劑所阻斷(P0.01)。給予去勢雌性SHR大鼠睪酮及淫羊藿高劑量干預能夠明顯降低心率(P0.01),而雌二醇對心率無明顯影響(P0.05)。④睪酮能夠增加去勢雄性SHR大鼠心臟及左右腎臟重量(P0.01)。與雌性WKY組大鼠相比,雌性SHR組大鼠脾臟重量明顯增加(P0.01)。睪酮能夠增加去勢雌性SHR大鼠心臟、子宮及左右腎臟重量(P0.01),而降低脾臟重量(P0.01)。雌二醇能夠降低去勢雌性SHR大鼠脾臟重量明顯(P0.01),卻對心臟及雙腎重量無明顯影響(P0.05)；淫羊藿苷高劑量能夠降低去勢雌性SHR大鼠脾臟重量(P0.01)。⑤大鼠主動脈HE及Masson染色結果示：雌雄去勢SHR大鼠較其同一性別WKY對照組主動脈的纖維化程度高。給予雄性去勢SHR大鼠雌二醇及淫羊藿苷干預能夠降低其主動脈纖維化程度,而給予睪酮卻無明顯改善。且淫羊藿苷改善去勢雄性SHR大鼠主動脈纖維化的作用能夠被雄激素受體拮抗劑阻斷。給予雌性去勢SHR大鼠雌二醇及淫羊藿苷干預能夠降低其主動脈纖維化程度,而給予睪酮則無明顯改善。且淫羊蓿苷降低去勢雌性SHR大鼠主動脈纖維化的作用能夠部分被雌激素受體拮抗劑所阻斷。⑥各組大鼠外周血流式細胞檢測結果：睪酮及淫羊藿苷能夠降低去勢雄性SHR大鼠外周血中Th細胞分化比例(P0.01),雌二醇卻無明顯影響(P0.05)。雌二醇、睪酮、淫羊藿苷對去勢雌性SHR大鼠外周血Th細胞無明顯影響(P0.05)。睪酮、淫羊藿苷能夠降低去勢雄性SHR大鼠外周血Tc細胞分化比例(P0.05),而雌二醇卻無此作用(P0.05)。且淫羊藿苷的作用能夠被雄激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇、淫羊藿苷能夠降低去勢雌性SHR大鼠外周血Tc細胞分化比例(P0.05),而睪酮無此作用(P0.05)。睪酮、淫羊藿苷能夠增加去勢雄性SHR大鼠外周血Tregs細胞分化比例(P0.05或P0.01),而雌二醇卻無此作用(P0.05)。雌二醇、淫羊藿苷能夠升高去勢雌性SHR大鼠外周血Tregs細胞分化比例(P0.01),而睪酮無此作用(P0.05)。且淫羊藿苷的作用能夠被雌激素受體拮抗劑阻斷(P0.01)。⑦各組大鼠脾細胞流式細胞檢測結果：雌二醇、睪酮及淫羊藿苷對去勢雌雄性SHR大鼠脾細胞中Th細胞分化比例皆無明顯影響(P0.05)。睪酮及淫羊藿苷能夠降低去勢雄性SHR大鼠脾細胞中Tc分化比例(P0.05),而雌二醇無此作用(P0.05)。且淫羊藿苷的作用能夠部分被雄激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇及淫羊藿苷有降低去勢雌性SHR大鼠脾細胞中Tc分化比例的趨勢(P0.05),且淫羊藿苷的作用能夠部分被雌激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。淫羊藿苷能夠增加去勢雄性SHR大鼠脾細胞中Tregs分化比例(P0.05),睪酮有增加去勢雄性SHR大鼠脾細胞中Tregs分化比例的趨勢(P0.05),而雌二醇無此作用(P0.05),且淫羊藿苷的作用能夠部分被雄激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能夠增加去勢雌性SHR大鼠脾細胞中Tregs分化比例(P0.01或P0.05),而睪酮無此作用(P0.05),且淫羊藿苷的作用能夠被雌激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇、睪酮及淫羊藿苷能夠降低去勢雄性SHR大鼠T細胞細胞因子TNF-α含量(P0.01)。且淫羊藿苷的作用能夠部分被雄激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能夠降低去勢雌性SHR大鼠T細胞細胞因子TNF-α含量(P0.05),而睪酮無此作用(P0.05),且淫羊藿苷的作用能夠部分被雌激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇及淫羊藿苷對去勢雄性SHR大鼠T細胞細胞因子IL-17含量無明顯影響(P0.05),而睪酮能夠明顯升高IL-17含量(P0.01)。雌二醇、睪酮及淫羊藿苷能夠降低去勢雌性SHR大鼠T細胞細胞因子IL-17含量(P0.01)。⑨血清雌二醇、睪酮、AngⅡ、TNF-α,1L-17,IL-10含量Elisa檢測結果：雌二醇能夠升高去勢雄性SHR大鼠血清E2水平(P0.01),而睪酮及淫羊藿苷無此作用(P0.05)。雌二醇及睪酮都能夠升高去勢雌性SHR大鼠血清E2水平(P0.05),而淫羊藿苷卻不能(P0.05)。雌二醇、睪酮及淫羊藿苷皆對去勢雄性SHR大鼠血清睪酮水平無明顯影響(P0.05)。雌二醇能夠降低去勢雌性SHR大鼠血清睪酮水平(P0.05),而睪酮能夠明顯升高去勢雌性SHR大鼠血清睪酮水平(P0.01),而淫羊藿苷對睪酮水平無影響(P0.05)。雌二醇能夠一定程度降低去勢雄性SHR大鼠血清AngⅡ水平(P0.05),睪酮能夠增加其血清AngⅡ水平(P0.01),淫羊藿苷能夠明顯降低AngⅡ水平(P0.05或P0.01)。雌二醇能夠降低去勢雌性SHR大鼠血清AngⅡ水平(P0.01),而睪酮明顯升高其AngⅡ水平(P0.01),而淫羊藿苷對AngⅡ水平無影響(P0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能夠降低去勢雄性SHR大鼠血清TNF-α水平(P0.01),而睪酮能夠升高其TNF-α水平(P0.01),且淫羊藿苷作用能夠部分被雄激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇能夠降低去勢雌性SHR大鼠血清TNF-α水平(P0.01),而睪酮有升高其TNF-α水平的趨勢(P0.05),而淫羊藿苷對TNF-α水平無影響(P0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能夠減低去勢雄性SHR大鼠血清IL-17水平(P0.01),而睪酮有升高其血清IL-17水平的趨勢(P0.05)。且淫羊藿苷作用能夠部分被雄激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇能夠降低去勢雌性SHR大鼠血清IL-17水平(P0.01),而睪酮有升高其IL-17水平的趨勢(P0.05),且淫羊藿苷的作用能夠被雌激素受體拮抗劑阻斷(P0.01)。⑩大鼠主動脈雌、雄激素受體含量比較雌二醇能夠一定程度增加去勢雄性SHR大鼠主動脈ERp表達水平(P0.05),而睪酮對ERp表達水平無明顯影響(P0.05),淫羊藿苷能夠降低ERp表達水平(P0.01)。雌二醇及睪酮能夠一定程度增加去勢雌性SHR大鼠主動脈ERβ表達水平(P0.05),而淫羊藿對ERβ表達水平無明顯影響(P0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能夠明顯降低去勢雄性SHR大鼠主動脈AR表達水平(P0.01),而睪酮對其AR表達水平無明顯影響(P0.05),且淫羊藿苷的作用能夠部分被雄激素受體拮抗劑阻斷(P0.05)。雌二醇、睪酮及淫羊藿苷皆能降低去勢雌性SHR大鼠主動脈AR表達水平(P0.01)。結論：1.雌二醇能夠降低去勢雌性SHR大鼠的血壓,這一作用是與雌二醇降低AngⅡ的釋放,改善主動脈纖維化及炎癥細胞浸潤,增加其外周血及脾細胞中T細胞Tregs亞型的分化比例而降低Tc亞型的分化比例有關。而雌二醇降低去勢雄性SHR大鼠血壓與雌二醇對外周血及脾細胞中T細胞亞型分化比例的調節(jié)無關。2.睪酮能夠升高去勢雌、雄SHR大鼠的血壓,降低雌、雄SHR大鼠的心率。此作用是與睪酮增加AngⅡ的釋放,增加主動脈纖維化及炎癥細胞浸潤有關,而與調節(jié)外周血及脾細胞中T細胞亞型分化比例無關。3.淫羊藿苷具有類性激素作用,在不增加去勢雌、雄SHR大鼠血清雌二醇及睪酮水平及雌、雄受體表達的情況下,能夠降低血清AngⅡ水平,降低去勢雌、雄SHR大鼠的血壓及心率,降低其主動脈纖維化及炎癥浸潤,降低其外周血及脾細胞Tc細胞亞型分化,增加外周血及脾細胞Tregs細胞亞型分化,降低T細胞中細胞因子TNF-α及IL-17表達,且這些作用部分是通過與雌、雄受體結合后實現(xiàn)的,能夠部分被雌、雄受體拮抗劑阻斷。
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【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R259

【參考文獻】

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本文編號：2049753