本文選題：脾虛證兒童　切入點(diǎn)：唾液淀粉酶　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的：“脾主涎”,涎,即唾液。檸檬酸刺激前后唾液淀粉酶(sal ivary alpha amylase, sAA)活性比值下降作為脾虛證診斷客觀參考指標(biāo)已較得到公認(rèn),有研究顯示,成人脾虛證存在自主神經(jīng)功能紊亂,且其酸刺激后sAA活性低下與唾液總糖蛋白及sAA的N-糖基化不完全有關(guān),另外,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)脾虛證患者存在多個(gè)參與N-聚糖合成的糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)異常。以上研究多以成人脾虛證患者為對(duì)象,而對(duì)于發(fā)病或處于亞健康狀態(tài)兒童,脾虛證作為主證或兼夾證,在中醫(yī)證型分布中占有較高的比例,但目前尚少見(jiàn)有脾虛證兒童sAA活性比值的研究資料發(fā)表�，F(xiàn)代研究表明,sAA,活性主要受sAA基因(AMY1)拷貝數(shù)、蛋白含量及其N(xiāo)-糖基化修飾影響,且sAA蛋白N-糖基化修飾及分泌主要受交感神經(jīng)調(diào)控。本文研究脾虛證兒童檸檬酸刺激前后sAA活性比值變化,以及AMY1拷貝數(shù)、sAA蛋白含量、N-糖基化和非糖基化sAA含量改變,旨在為脾虛證兒童采用酸刺激前后sAA活性比值作為臨床診斷參考指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù),并探討sAA,活性比值下降與AMY1表達(dá)及sAA,的N-糖基化修飾是否有關(guān)聯(lián)�！捌⒃谖稙楦省�,甘即甜味,臨床上看到部分脾功能失調(diào)者出現(xiàn)口中甘味。近有研究表明,甜味覺(jué)可以誘導(dǎo)胰島素頭相反應(yīng)(cephalic phase insulin release, CPIR),與人類(lèi)糖代謝關(guān)系密切；甜味覺(jué)還可以激活大腦多巴胺能、5-羥色胺能和內(nèi)源性肽能神經(jīng)系統(tǒng),進(jìn)而影響食欲。另外,古代與現(xiàn)代均認(rèn)識(shí)到脾與糖脂代謝有密切聯(lián)系。根據(jù)“脾在味為甘”以及脾與代謝病發(fā)病的相關(guān)論述,本文選用甜味受體基因差異小鼠進(jìn)行甜味覺(jué)刺激實(shí)驗(yàn),觀察小鼠機(jī)體糖代謝反應(yīng)情況,初步探討從甜味覺(jué)受體角度研究脾虛證的可能性。研究方法：1.脾虛證兒童檸檬酸刺激前后唾液分泌變化研究1.1檸檬酸刺激采集唾液方法學(xué)考察目前,sAA活性比值實(shí)驗(yàn)中檸檬酸刺激采集唾液的方法并不規(guī)范,如酸刺激強(qiáng)度沒(méi)有明確的界定、酸刺激開(kāi)始后唾液的采集也沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)等。成人相比于兒童具有更好的順應(yīng)性,利于考察檸檬酸刺激采集唾液方法學(xué)。2012年10月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)校園以廣告形式募集9例健康成人志愿者(女性5例、男性4例),平均年齡25.2±1.1歲(24-27歲)。統(tǒng)一唾液采集前準(zhǔn)備及采集時(shí)的體位,利用5種不同規(guī)格的檸檬酸濾紙,分別為0.2M/0.5×(0.2M代表檸檬酸濃度為0.2mmol/L,0.5×代表檸檬酸濾紙面積為0.5 cm×0.5 cm)、0.2M/1×、0.2M/2×、0.1M/1×和0.4M/1×,以定時(shí)的方法對(duì)每一位志愿者分別采集刺激前2 min、刺激時(shí)1 min和刺激后2 min唾液,測(cè)定sAA活性和唾液流率,考察不同濃度和面積的檸檬酸濾紙對(duì)sAA活性比值和唾液流率的影響(酸刺激時(shí)sAA活性比值=刺激時(shí)sAA活性／刺激前sAA活性,酸刺激后sAA活性比值=刺激后sAA活性／刺激前sAA活性)。1.2從唾液中提取基因組DNA方法學(xué)考察1.2.1碘化鉀法與試劑盒法比較比較碘化鉀法與標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)試劑盒法對(duì)新鮮和室溫保存一周唾液中(即口腔黏膜脫落細(xì)胞)提取基因組DNA方法學(xué),初步驗(yàn)證碘化鉀法可靠性及穩(wěn)定性,為后續(xù)兒童基因組DNA提取及AMY1基因拷貝數(shù)測(cè)定提供參考依據(jù)。2013年3月于廣東藥學(xué)院校園以廣告形式募集6例健康成人志愿者,分別利用碘化鉀法和口腔拭子基因組DNA提取試劑盒法,提取新鮮和室溫保存一周的唾液基因組DNA。DNA提取后,1%的瓊脂糖凝膠電泳,并測(cè)定DNA含量(即得率)和純度(D260/D280、D260/D230);接著,以提取的唾液基因組DNA樣品作為模板,PCR擴(kuò)增腫瘤蛋白TP53基因和唾液特異蛋白PRB-3基因,PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。1.2.2擴(kuò)大樣本驗(yàn)證碘化鉀法碘化鉀法為課題組參考文獻(xiàn)改進(jìn)而來(lái),本研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證該法的可靠性及穩(wěn)定性。2013年3月至11月,以廣告形式從廣州市海珠區(qū)婦幼保健院和廣東藥學(xué)院校園分別募集47名健康兒童和52名健康成人,采集唾液標(biāo)本后-80℃保存,并在一星期內(nèi)以碘化鉀法提取基因組DNA。DNA提取后,DNA含量和純度測(cè)定以及體外PCR擴(kuò)增驗(yàn)證如上述；另外,為了探討唾液中微生物和食物殘?jiān)欠駮?huì)干擾PCR擴(kuò)增,本研究還對(duì)碘化鉀法提取的基于因組DNA進(jìn)行了TP53基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。1.3病例選擇及分組對(duì)照設(shè)計(jì)1.3.1脾虛證和健康兒童選擇中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)、病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：1、中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：兒童脾虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)參考中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合研究會(huì)兒科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第二屆學(xué)術(shù)會(huì)議制定草案(1999年,廈門(mén))修改。主要指標(biāo)：(1)食欲不振；(2)大便失調(diào)(包括泄瀉,大便雖成形,次數(shù)增多或大便難解)；(3)面色萎黃少華；(4)形體消瘦(體重低于正常同齡同性別平均值10%)；(5)舌質(zhì)淡,苔薄白。次要指標(biāo)：(1)肢倦乏力；(2)腹脹；(3)輕度浮腫；(4)輕度貧血；(5)口流清涎；(6)睡時(shí)露睛或多汗；(7)脈細(xì)弱、無(wú)力、指紋淡(3歲以下)。判斷：凡符合主要指標(biāo)4項(xiàng)或主要指標(biāo)2項(xiàng)加次要指標(biāo)1項(xiàng)均可診斷脾虛證。2、脾虛證兒童納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡5-12歲兒童,符合上述兒童脾虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)。3、排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、腦、肝、腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾��；(2)過(guò)敏體質(zhì)、感染性疾病發(fā)病期、精神性疾��；(3)近1個(gè)月有使用哮喘、風(fēng)濕、止痛及精神類(lèi)藥物者。4、健康兒童納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡5-12歲,無(wú)明顯的西醫(yī)診斷疾病,中醫(yī)辨證陰陽(yáng)平和者。1.3.2消瘦和健康兒童選擇考察消瘦兒童檸檬酸刺激前后sAA活性變化分子機(jī)制對(duì)探討兒童脾虛證本質(zhì)有一定參考價(jià)值。在上述收集的全部脾虛證和健康對(duì)照兒童病例中,經(jīng)過(guò)測(cè)量身高(cm)和體重(kg)后,根據(jù)6個(gè)大型國(guó)際流行病學(xué)調(diào)查界定的標(biāo)準(zhǔn),以體重指數(shù)(body mass index, BMI)將其分為低BMI(消瘦)和正常BMI(健康)兒童；另外,根據(jù)中國(guó)肥胖工作組設(shè)立的標(biāo)準(zhǔn)排除超重或肥胖兒童。1.4唾液采集與指標(biāo)測(cè)定1.4.1唾液采集兒童唾液采集方法和流程基于本實(shí)驗(yàn)前述成人唾液采集方法學(xué)考察結(jié)果進(jìn)行改進(jìn)。兒童受試者先靜坐10 min,充分休息,采取坐位、頭稍前傾、眼睛睜開(kāi)的體位,然后通過(guò)吞咽的方法將口腔唾液排凈后,讓唾液在口腔匯聚3 min后一次性自然流出,獲得刺激前唾液；緊接著,用含0.4 mol/L檸檬酸、大小為1 cm×1 cm的濾紙,刺激舌尖1 min,然后快速一次性收集檸檬酸刺激后唾液。在酸刺激期間,囑受試者將舌尖抬起以避免檸檬酸進(jìn)入唾液,影響唾液pH值。1.4.2唾液指標(biāo)測(cè)定唾液流率、pH值及總蛋白測(cè)定：唾液流率即為唾液體積(mL)與收集耗時(shí)(min)的比值(mL/min);pH精密試紙測(cè)定唾液pH值；BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定唾液總蛋白含量(mg/mL)。sAA活性測(cè)定：利用國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)所推薦的EPS-G7速率法,來(lái)測(cè)定sAA活性(U/mL)。sAA比活(U/mg)=sAA活性(U/mL)/總蛋白含量(mg/mL)。sAA含量測(cè)定：通過(guò)引進(jìn)已知含量的人源sAA標(biāo)準(zhǔn)品,利用Western blot (WB)的方法測(cè)定檸檬酸刺激前后唾液樣品中糖基化、非糖基化及總sAA的含量(mg/mL)。sAA糖基化水平即糖基化sAA含量占總sAA含量的比例。AMY1基因拷貝數(shù)測(cè)定：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)前述從唾液中提取基因組DNA方法學(xué)考察結(jié)果,利用碘化鉀法提取兒童唾液基因組DNA后,對(duì)AMY1基因和腫瘤蛋白TP53基因(內(nèi)參基因)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。通過(guò)引進(jìn)已知含14個(gè)AMY1基因拷貝數(shù)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品,以2“△Ct*14的方法算出待測(cè)DNA樣品AMY1基因拷貝數(shù)。1.5統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行作圖并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以X±SD表示,刺激前后唾液指標(biāo)組內(nèi)比較進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)系數(shù)。PO.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.小鼠甜味覺(jué)差異與代謝及食欲等生理與行為學(xué)指標(biāo)相關(guān)性研究2.1動(dòng)物倫理、模型及分組倫理：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)賓夕法尼亞大學(xué)附屬莫奈爾中心相關(guān)倫理委員會(huì)審查通過(guò),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員盡最大努力減少動(dòng)物痛苦。模型：選擇同窩雌雄129.B6-Taslr3同源異基因小鼠,代數(shù)為N17F9,由莫奈爾中心Dr. Bachmanov實(shí)驗(yàn)室培育。該系小鼠是利用129P3/J(129)和C57BL/6ByJ(B6)小鼠雜交后產(chǎn)生F1代,接著F1雜合后代F2再與129回交超過(guò)10次培育而成。經(jīng)TaqMan的SNP基因座鑒定分析方法鑒定,該系小鼠含兩種基因型,分別是129/B6-Taslr3雜合小鼠(簡(jiǎn)寫(xiě)：B6/129)和129/129-Taslr3純合小鼠(簡(jiǎn)寫(xiě)：129/129)。雜合小鼠即B6/129除4號(hào)染色體有一小段來(lái)自B6外,其他與129完全一致,該段染色體含數(shù)個(gè)基因,而Taslr3被證實(shí)是唯一影響小鼠甜味覺(jué)的基因,故兩種基因型小鼠甜味覺(jué)有顯著差異,而其他一般生物學(xué)特性,如外貌、習(xí)性及解剖學(xué)等特點(diǎn)并無(wú)明顯差異。分組：以129/129純合小鼠為對(duì)照組,以含外源性基因的B6/129雜合小鼠為實(shí)驗(yàn)組,兩組小鼠數(shù)量在12只到29只不等。2.2實(shí)驗(yàn)條件動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)附屬莫奈爾中心Dr. Bachmanov實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)在溫度為23℃以及12：12小時(shí)的光暗周期(上午7：00燈光自動(dòng)打開(kāi)直至晚上7：00熄燈)環(huán)境中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,新生的性別相同的同窩小鼠飼養(yǎng)于同一小鼠盒子,每個(gè)盒子小鼠數(shù)量在1至6只之間不等數(shù)量,飼養(yǎng)至二月大(2-mo)；開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后(2-mo),將同盒的雄性小鼠分開(kāi),單獨(dú)飼養(yǎng)于獨(dú)立的盒子,而雌性小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于同盒,直至完成全部實(shí)驗(yàn)。另外,小鼠飼料為T(mén)eklad Rodent Diet 8604,該飼料含70%左右的淀粉類(lèi)食物(如玉米淀粉),飲用水為莫奈爾中心提供的去離子水。2.3實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目2.3.1糖精喜好實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)兩組小鼠的甜味覺(jué)差異,為后續(xù)研究甜味覺(jué)差異對(duì)小鼠生理與行為學(xué)影響作鋪墊。在2-mo至6-mo之間,采用經(jīng)典的two-bottle test,測(cè)量?jī)山M小鼠對(duì)2 mM和10 mM糖精溶液的喜好程度及攝入量,每個(gè)濃度糖精溶液測(cè)量96小時(shí)(去離子水作為第二選擇)。糖精和水的每日攝入量用每30 g小鼠體重表示(mL/30g BW)或以相對(duì)百分比表示(%,糖精或水的攝入量／總液體攝入量)。2.3.2糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)甜味覺(jué)差異會(huì)引起糖代謝的變化,本實(shí)驗(yàn)可以考察兩組小鼠糖代謝情況。當(dāng)小鼠2-mmo大時(shí),每只小鼠首先接受腹腔注射的糖耐量實(shí)驗(yàn)(IP GTT),接著是灌胃注射糖耐量實(shí)驗(yàn)(IG GTT),然后是胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT),各實(shí)驗(yàn)間隔一周左右以洗脫實(shí)驗(yàn)間相互影響；當(dāng)小鼠6-mmo大時(shí),進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。2.3.3 LabMaster分析實(shí)驗(yàn)甜味覺(jué)差異可以引起食欲變化,本實(shí)驗(yàn)可以分析兩組小鼠多個(gè)生理與行為學(xué)指標(biāo)(含食欲)。分別在2-mo和6-mo對(duì)小鼠進(jìn)行核磁共振(見(jiàn)下述)分析后約一周,利用LabMaster系統(tǒng)對(duì)小鼠的能量代謝、活動(dòng)量、進(jìn)食及飲水量等進(jìn)行測(cè)量。該系統(tǒng)每隔30 min對(duì)小鼠的吸入氧氣量(VO2)、呼出二氧化碳量(VCO2)、呼吸交換率(respiratory exchange ratio, RER)、能量消耗(energy expenditure, EE)、水平和垂直活動(dòng)量以及飲水和進(jìn)食量進(jìn)行測(cè)量記錄,連續(xù)記錄5天。其中,RER和EE可以考察小鼠能量代謝情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,數(shù)據(jù)進(jìn)行平均化處理,得到24小時(shí)(一個(gè)晝夜周期)的平均數(shù)據(jù)進(jìn)行展示。2.3.4體重曲線和身體成分構(gòu)成分析實(shí)驗(yàn)糖代謝、食欲及能量代謝等差異影響小鼠身體成分構(gòu)成,分析小鼠體重曲線及身體成分構(gòu)成有助于深入分析小鼠甜味覺(jué)差異的生理病理影響,如脂代謝。體重曲線：小鼠體重分別在2-mo、3-mo、4-mo、5-mo和6-mo時(shí)于上午10：00左右進(jìn)行測(cè)量,精確到0.1 g,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后繪制體重曲線。核磁共振(NMR)：在小鼠分別完成2-mo和6-mmo的ITT后第二天,利用Bruker Minispec LF 110對(duì)小鼠進(jìn)行掃描,分析身體成分構(gòu)成；雙能X線吸收測(cè)量法(DEXA):在6-mo的LabMaster分析實(shí)驗(yàn)后約一周,用吸入C02法將小鼠安樂(lè)死,利用Lunar PIXImus Ⅱ densitometer的雙能X線吸收測(cè)量法對(duì)小鼠身體成分進(jìn)行分析；解剖：對(duì)小鼠進(jìn)行DEXA后,解剖脂肪組織和內(nèi)臟器官并稱(chēng)重。2.4統(tǒng)計(jì)分析采用Statistica (version 10)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SE)表示,采用ANOVA或GLM對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,比較采用post hoc (Fisher LSD test),作圖采用Excel或Statistica, P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1.不同濃度和面積檸檬酸刺激對(duì)健康成人唾液分泌的影響同一檸檬酸濃度下(0.2M),與面積為0.5×的濾紙比較,面積為1×和2×的濾紙刺激時(shí)和刺激后sAA活性比值均顯著提高(P0.05),而以2×提高更明顯；并且,除0.5×外,1×和2×刺激時(shí)和刺激后sAA活性比值均高于1(即酸刺激下sAA活性升高),且刺激后sAA活性比值均顯著高于自身刺激時(shí)(P0.05)。另外,與0.5×和1×比較,2×刺激下唾液流率增加較為明顯。同一濾紙面積下(1×),不同濃度檸檬酸(0.1M、0.2M和0.4M)刺激下均能顯著提高sAA活性,但與0.1M或0.2M比較,0.4M刺激時(shí)和刺激后sAA活性比值均顯著提高(P0.05)；并且,除0.1M外,0.2M和0.4M刺激后sAA活性比值高于自身刺激時(shí)(P0.05)。另外,與0.1M和0.2M比較,0.4M刺激下唾液流率增加較為明顯。研究結(jié)果提示,0.2M/2×或0.4M/1×檸檬酸濾紙可以顯著增加成人唾液的分泌和sAA活性,且刺激后sAA活性比值明顯高于刺激時(shí)。2.不同保存條件和提取方法對(duì)從唾液中提取基因組DNA的影響2.1碘化鉀法與試劑盒法提取新鮮和室溫保存唾液DNA的比較2.1.1基因組DNA的得率和純度從DNA提取的得率(u g)來(lái)看,試劑盒法提取新鮮唾液標(biāo)本獲得的DNA含量最高(2.64±0.34),顯著高于碘化鉀法(P0.05),而試劑盒法提取室溫保存一周的唾液標(biāo)本獲得的DNA含量最低(0.51±0.11),顯著低于碘化鉀法(P0.05)；碘化鉀法對(duì)兩種不同保存方法獲得的DNA含量居中,且差異不大。從提取純度(質(zhì)量)來(lái)看,碘化鉀法對(duì)新鮮唾液標(biāo)本提取的DNA的D260/D280值為2.0左右(1.99±0.05),而且對(duì)室溫保存樣本獲得DNA的D280/D280值更高(2.20±0.05),而試劑盒法對(duì)兩種保存方法獲得的DNA的D260/D280值都在1.8左右,均顯著低于碘化鉀法(P0.05)；另外,碘化鉀法提取的DNA的D260/D230值都明顯低于試劑盒法(P0.05)。研究結(jié)果提示,碘化鉀法對(duì)兩種不同保存條件下唾液DNA的得率比較穩(wěn)定,但可能也存在少量RNA和鹽離子、糖類(lèi)物質(zhì)的殘留。2.1.2基因組DNA電泳結(jié)果兩種方法對(duì)新鮮唾液樣本提取的DNA在23 kb附近都有一條明顯的主帶,但是試劑盒法獲得的DNA拖尾現(xiàn)象明顯,提示DNA存在的降解；兩種方法對(duì)于室溫放置7天的唾液標(biāo)本提取的DNA,都存在一定程度的降解,尤其是試劑盒法獲得DNA樣品降解嚴(yán)重,其中一個(gè)標(biāo)本幾乎沒(méi)有明顯的主帶。結(jié)果提示碘化鉀法對(duì)提取兩種不同保存條件下唾液DNA的降解程度較輕。2.1.3基因組DNA體外PCR擴(kuò)增兩種不同提取方法和保存條件下得到的DNA樣品對(duì)TP53(192 bp)和PRB-3(1261bp)基因都有非常好的PCR擴(kuò)增效果,PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。2.2碘化鉀法提取-80℃凍存唾液DNA考察碘化鉀法對(duì)-80℃凍存唾液標(biāo)本提取的基因組DNA的得率、純度以及電泳結(jié)果都與碘化鉀法提取新鮮唾液標(biāo)本的結(jié)果一致,無(wú)明顯差異；另外,其DNA樣品對(duì)TP53和PRB-3基因也都有非常好的PCR擴(kuò)增效果。此外,熒光定量PCR結(jié)果顯示,TP53基因有很好的熒光擴(kuò)增曲線,并且熒光融解曲線只有一個(gè)特征峰,提示唾液中微生物和食物殘?jiān)粫?huì)干擾人源基因組DNA的PCR擴(kuò)增。研究結(jié)果提示,相對(duì)于商業(yè)試劑盒法,碘化鉀法可以快速穩(wěn)定地從不同保存條件下的唾液中提取足量和高質(zhì)量的DNA。3.脾虛證兒童酸刺激前后唾液指標(biāo)變化3.1一般資料在2013年4月至11月,于廣州市海珠區(qū)婦幼保健院中醫(yī)科,共收集20例脾虛證兒童及29例健康對(duì)照組兒童。脾虛證兒童中,男10例、女10例,平均年齡8±2歲；健康對(duì)照組兒童中,男15例、女14例,平均年齡7±3歲,兩組兒童的年齡和性別構(gòu)成無(wú)明顯差異(P0.05)。所有參與本研究?jī)和母改富虮O(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。3.2脾虛證兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標(biāo)組內(nèi)比較健康兒童組酸刺激前后比較,酸刺激后sAA活性、sAA含量、糖基化sAA含量及非糖基化sAA含量相對(duì)于酸刺激前明顯提高(P均0.05)；另外,唾液流率及pH值也顯著提高(P0.05),研究提示健康兒童唾液分泌對(duì)檸檬酸刺激反應(yīng)良好。脾虛證兒童組酸刺激前后比較,酸刺激后只有唾液流率、pH值及sAA糖基化水平顯著提高(P0.05),其余指標(biāo)如sAA活性等均無(wú)明顯提高,提示脾虛證兒童酸負(fù)荷下唾液分泌反應(yīng)減弱。3.3脾虛證兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標(biāo)組間比較脾虛證兒童酸負(fù)荷下sAA活性比值(1.87±1.04)相對(duì)于健康兒童(2.72±1.58)明顯降低(P0.05),提示酸負(fù)荷下脾虛證兒童sAA活性增加的幅度明顯低于健康兒童,與文獻(xiàn)報(bào)道成人脾虛證研究結(jié)果類(lèi)同。脾虛證兒童sAA糖基化水平比值(1.54±0.63)相對(duì)于健康兒童(1.20±0.45)則顯著提高(P0.05),提示酸負(fù)荷下脾虛證兒童sAA糖基化異常。兩組兒童AMY1基因拷貝數(shù)(脾虛證兒童：8.57±3.21,健康兒童：7.85±2.70)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(170.05),提示AMY1基因拷貝數(shù)對(duì)脾虛證兒童sAA活性比值改變可能無(wú)影響。4.消瘦兒童酸刺激前后唾液指標(biāo)變化4.1一般資料收集的49例兒童中,共有43例兒童受試者納入研究。其中,消瘦組兒童21例,男10例、女11例,平均年齡8±2歲；健康對(duì)照組兒童22例,男13例、女9例,平均年齡8±2歲,兩組兒童的年齡和性別構(gòu)成無(wú)明顯差異(P0.05)。4.2消瘦兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標(biāo)組間比較兩組兒童刺激前后sAA含量和活性均無(wú)顯著差異(P0.05)。然而,消瘦兒童的sAA活性比值(1.6±0.8)相對(duì)于健康兒童(2.3±1.0)明顯降低(P0.05)；并且,消瘦兒童的sAA含量比值(1.1±0.7)相對(duì)于健康兒童(2.0±1.2)也顯著降低(P0.05),提示消瘦兒童酸負(fù)荷下的sAA分泌反應(yīng)低下,與脾虛證兒童研究結(jié)果類(lèi)似。另外,健康和消瘦兒童AMY1基因拷貝數(shù)平均值分別為7.6±2.7和8.0±2.1,兩組兒童AMY1基因拷貝數(shù)并無(wú)顯著差異(P0.05),結(jié)果提示AMY1基因拷貝數(shù)對(duì)消瘦兒童sAA活性比值改變可能無(wú)影響。5.甜味覺(jué)差異對(duì)小鼠糖代謝及食欲等的影響5.1 B6/129和129/129小鼠甜味覺(jué)差異B6/129小鼠對(duì)2 mM糖精溶液的攝入量(7.3±0.6 ml/30 g BW)及喜好程度(91.9±1.1%)相對(duì)于129/129小鼠的攝入量(4.6±0.2 ml/30 g BW)和喜好程度(71.3±2.8%)均明顯提高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；對(duì)于更高濃度糖精溶液(10mM),B6/129小鼠的攝入量(14.1±2.2 ml/30 g BW)相對(duì)于129/129小鼠(7.8±0.6 ml/30 g BW)也明顯提高(P0.05),結(jié)果提示含來(lái)源于B6的Taslr3等位基因小鼠即B6/129雜合小鼠,甜味覺(jué)病理性過(guò)高。5.2 B6/129和129/129小鼠糖代謝比較5.2.1糖耐量實(shí)驗(yàn)腹腔注射葡萄糖后,6-mo時(shí)基因型效應(yīng)對(duì)小鼠血糖代謝的影響是顯著的(P0.05), post hoc比較發(fā)現(xiàn)雄性B6/129小鼠血糖在5min、45min、60 min以及90 min時(shí)均顯著高于雄性129/129小鼠(P0.05),結(jié)果表明腹腔注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對(duì)受損。灌胃注射后,2-mo時(shí)雄性B6/129小鼠血糖水平在灌胃注射后15 min、30 min和45 min均顯著高于129/129小鼠(P0.05)；并且,6-mo時(shí)雄性B6/129小鼠在灌胃后30 min的血糖水平也顯著高于129/129小鼠(P0.05),結(jié)果表明灌胃注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對(duì)受損。相對(duì)129/129小鼠,含外源性基因的B6/129小鼠腹腔及灌胃注射糖耐量均受損,符合脾虛證糖耐量異�；蚴軗p的特征。5.2.2胰島素耐量實(shí)驗(yàn)注射胰島素后,兩組小鼠血糖水平開(kāi)始急劇下降,并于60 min左右達(dá)到最低水平,之后開(kāi)始緩慢上升,然而,小鼠血糖在120 min實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)并未恢復(fù)到基礎(chǔ)值。本研究并未發(fā)現(xiàn)顯著的基因型效應(yīng)(P0.05),結(jié)果提示兩組小鼠對(duì)胰島素敏感性相似。5.3 B6/129和129/129小鼠LabMaster比較5.3.1進(jìn)食量和飲水量分析基因型效應(yīng)對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響接近顯著(P=0.059), post hoc比較顯示：2-mo時(shí),129/129小鼠在21：00、08：00和11：00三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的進(jìn)食量顯著高于B6/129小鼠(P0.05)；6-mo時(shí),129/129小鼠在17：00(P=0.082)和18：00(P=0.070)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的進(jìn)食量可能高于B6/129小鼠。研究提示,相對(duì)于129/129小鼠,B6/129小鼠的平均進(jìn)食量可能更低�；蛐托�(yīng)對(duì)小鼠飲水量的影響是顯著的(P0.05), post hoc比較顯示：2-mo時(shí),129/129小鼠在21：00和12：00兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的飲水量顯著高于B6/129小鼠(P0.05),而6-mo時(shí),129/129小鼠在20：00和23：00兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的飲水量也顯著高于B6/129小鼠(P0.05)�？梢�(jiàn),相對(duì)于129/129小鼠,B6/129小鼠的平均飲水量顯著降低。結(jié)果提示,B6/129小鼠進(jìn)食和飲水量顯著降低,進(jìn)一步推測(cè)其更符合脾虛證特征。5.3.2呼吸交換率(RER)和能量消耗(EE)分析2-mo時(shí),post hoc顯示雄性129/129小鼠在11：00、12：00、13：00、14：00和15：00五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RER均顯著高于雄性B6/129小鼠(K0.05)；6-mo時(shí),雌性129/129小鼠在00：00、03：00和04：00三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RER均顯著高于雌性B6/129小鼠(K0.05),并且,雄性129/129小鼠在14：00和15：00兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RER也顯著高于雄性B6/129小鼠(P0.05)。可見(jiàn),相對(duì)于129/129小鼠,B6/129的RER顯著降低�；蛐托�(yīng)對(duì)小鼠的EE有顯著的影響,即129/129小鼠的能量消耗顯著高于同年齡B6/129小鼠(P0.05)。隨著時(shí)間推移,129/129小鼠(特別是雌性)EE下降明顯,而B(niǎo)6/129小鼠則相對(duì)穩(wěn)定�？梢�(jiàn),相對(duì)于129/129小鼠,B6/129小鼠EE水平較低,但相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)果提示,B6/129的RER及EE顯著降低,能量代謝可能異常,符合脾虛證特征。5.3.3活動(dòng)量分析基因型效應(yīng)對(duì)小鼠活動(dòng)量的影響是顯著的(P0.05),post hoc比較顯示B6/129小鼠在22：00、00：00、01：00和04：00四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活動(dòng)量顯著高于129/129小鼠(P0.05)�？梢�(jiàn),相對(duì)于129/129小鼠,B6/129小鼠平均活動(dòng)量更大。5.4 B6/129和129/129小鼠體重曲線和身體成分構(gòu)成比較5.4.1體重曲線本研究并未發(fā)現(xiàn)兩組小鼠體重增長(zhǎng)有明顯差異(P=0.564)。5.4.2身體成分構(gòu)成分析核磁共振(NMR)分析：年齡和基因型交互作用對(duì)小鼠脂肪含量有顯著影響(K0.05)。2-mmo時(shí),B6/129小鼠脂肪含量高于129/129小鼠,隨著時(shí)間推移,B6/129小鼠脂肪含量下降更明顯,以致6-mo時(shí),其脂肪含量卻低于同年齡129/129小鼠。研究提示,相對(duì)129/129小鼠,B6/129小鼠脂肪含量可能更高,但隨著時(shí)間推移下降相對(duì)明顯。雙能X線吸收測(cè)量法(DEXA)分析：GLM分析并未發(fā)現(xiàn)兩組小鼠各DEXA指標(biāo)有明顯差異,但B6/129小鼠的脂肪含量有高于129/129小鼠的趨勢(shì)。解剖分析： GLM分析顯示,基因型效應(yīng)對(duì)小鼠棕色脂肪含量有顯著的影響,即B6/129小鼠的棕色脂肪含量顯著高于129/129小鼠(必0.05)。結(jié)果提示,雖然兩組小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)顯著差異,但就脂肪含量來(lái)說(shuō),B6/129小鼠可能更高,特別是棕色脂肪含量,即B6/129小鼠脂代謝可能異常,亦符合脾虛證特征。結(jié)論：脾虛證兒童研究表明,患兒酸刺激后sAA活性比值下降,并伴有sAA糖基化水平異常升高,而AMY1基因拷貝數(shù)無(wú)顯著變化,結(jié)果提示酸刺激后sAA活性比值測(cè)定可作為兒童脾虛證臨床診斷客觀參考指標(biāo)之一,而sAA活性比值下降可能與其糖基化調(diào)控機(jī)制有關(guān)。消瘦兒童獲得與脾虛證兒童研究的類(lèi)似結(jié)果,提示脾虛是兒童消瘦的發(fā)病機(jī)制之一,同時(shí)也說(shuō)明消瘦作為脾虛證的證候診斷指標(biāo)之一是有科學(xué)依據(jù)的。小鼠實(shí)驗(yàn)研究表明,Taslr3同源異基因的B6/129小鼠甜味覺(jué)病理性過(guò)高,類(lèi)似《內(nèi)經(jīng)》“有病口甘者”,出現(xiàn)糖脂代謝異常、食欲下降及能量代謝紊亂等現(xiàn)象,提示B6/129小鼠有應(yīng)用于作為類(lèi)脾虛證小鼠模型進(jìn)行研究的可能,脾虛證可能存在“甜味覺(jué)-糖脂代謝”異常的發(fā)病機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R272

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 中國(guó)肥胖問(wèn)題工作組 ,季成葉;中國(guó)學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[J];中華流行病學(xué)雜志;2004年02期

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本文編號(hào)：1724730