本文選題：脾虛證兒童　切入點：唾液淀粉酶　出處：《廣州中醫(yī)藥大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的：“脾主涎”,涎,即唾液。檸檬酸刺激前后唾液淀粉酶(sal ivary alpha amylase, sAA)活性比值下降作為脾虛證診斷客觀參考指標已較得到公認,有研究顯示,成人脾虛證存在自主神經(jīng)功能紊亂,且其酸刺激后sAA活性低下與唾液總糖蛋白及sAA的N-糖基化不完全有關,另外,有學者發(fā)現(xiàn)脾虛證患者存在多個參與N-聚糖合成的糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達異常。以上研究多以成人脾虛證患者為對象,而對于發(fā)病或處于亞健康狀態(tài)兒童,脾虛證作為主證或兼夾證,在中醫(yī)證型分布中占有較高的比例,但目前尚少見有脾虛證兒童sAA活性比值的研究資料發(fā)表。現(xiàn)代研究表明,sAA,活性主要受sAA基因(AMY1)拷貝數(shù)、蛋白含量及其N-糖基化修飾影響,且sAA蛋白N-糖基化修飾及分泌主要受交感神經(jīng)調(diào)控。本文研究脾虛證兒童檸檬酸刺激前后sAA活性比值變化,以及AMY1拷貝數(shù)、sAA蛋白含量、N-糖基化和非糖基化sAA含量改變,旨在為脾虛證兒童采用酸刺激前后sAA活性比值作為臨床診斷參考指標提供科學依據(jù),并探討sAA,活性比值下降與AMY1表達及sAA,的N-糖基化修飾是否有關聯(lián)�！捌⒃谖稙楦省�,甘即甜味,臨床上看到部分脾功能失調(diào)者出現(xiàn)口中甘味。近有研究表明,甜味覺可以誘導胰島素頭相反應(cephalic phase insulin release, CPIR),與人類糖代謝關系密切；甜味覺還可以激活大腦多巴胺能、5-羥色胺能和內(nèi)源性肽能神經(jīng)系統(tǒng),進而影響食欲。另外,古代與現(xiàn)代均認識到脾與糖脂代謝有密切聯(lián)系。根據(jù)“脾在味為甘”以及脾與代謝病發(fā)病的相關論述,本文選用甜味受體基因差異小鼠進行甜味覺刺激實驗,觀察小鼠機體糖代謝反應情況,初步探討從甜味覺受體角度研究脾虛證的可能性。研究方法：1.脾虛證兒童檸檬酸刺激前后唾液分泌變化研究1.1檸檬酸刺激采集唾液方法學考察目前,sAA活性比值實驗中檸檬酸刺激采集唾液的方法并不規(guī)范,如酸刺激強度沒有明確的界定、酸刺激開始后唾液的采集也沒有統(tǒng)一的標準等。成人相比于兒童具有更好的順應性,利于考察檸檬酸刺激采集唾液方法學。2012年10月于廣州中醫(yī)藥大學校園以廣告形式募集9例健康成人志愿者(女性5例、男性4例),平均年齡25.2±1.1歲(24-27歲)。統(tǒng)一唾液采集前準備及采集時的體位,利用5種不同規(guī)格的檸檬酸濾紙,分別為0.2M/0.5×(0.2M代表檸檬酸濃度為0.2mmol/L,0.5×代表檸檬酸濾紙面積為0.5 cm×0.5 cm)、0.2M/1×、0.2M/2×、0.1M/1×和0.4M/1×,以定時的方法對每一位志愿者分別采集刺激前2 min、刺激時1 min和刺激后2 min唾液,測定sAA活性和唾液流率,考察不同濃度和面積的檸檬酸濾紙對sAA活性比值和唾液流率的影響(酸刺激時sAA活性比值=刺激時sAA活性／刺激前sAA活性,酸刺激后sAA活性比值=刺激后sAA活性／刺激前sAA活性)。1.2從唾液中提取基因組DNA方法學考察1.2.1碘化鉀法與試劑盒法比較比較碘化鉀法與標準商業(yè)試劑盒法對新鮮和室溫保存一周唾液中(即口腔黏膜脫落細胞)提取基因組DNA方法學,初步驗證碘化鉀法可靠性及穩(wěn)定性,為后續(xù)兒童基因組DNA提取及AMY1基因拷貝數(shù)測定提供參考依據(jù)。2013年3月于廣東藥學院校園以廣告形式募集6例健康成人志愿者,分別利用碘化鉀法和口腔拭子基因組DNA提取試劑盒法,提取新鮮和室溫保存一周的唾液基因組DNA。DNA提取后,1%的瓊脂糖凝膠電泳,并測定DNA含量(即得率)和純度(D260/D280、D260/D230);接著,以提取的唾液基因組DNA樣品作為模板,PCR擴增腫瘤蛋白TP53基因和唾液特異蛋白PRB-3基因,PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。1.2.2擴大樣本驗證碘化鉀法碘化鉀法為課題組參考文獻改進而來,本研究進一步擴大樣本驗證該法的可靠性及穩(wěn)定性。2013年3月至11月,以廣告形式從廣州市海珠區(qū)婦幼保健院和廣東藥學院校園分別募集47名健康兒童和52名健康成人,采集唾液標本后-80℃保存,并在一星期內(nèi)以碘化鉀法提取基因組DNA。DNA提取后,DNA含量和純度測定以及體外PCR擴增驗證如上述；另外,為了探討唾液中微生物和食物殘渣是否會干擾PCR擴增,本研究還對碘化鉀法提取的基于因組DNA進行了TP53基因熒光實時定量PCR擴增。1.3病例選擇及分組對照設計1.3.1脾虛證和健康兒童選擇中醫(yī)辨證標準、病例納入及排除標準：1、中醫(yī)辨證標準：兒童脾虛證辨證標準參考中國中西醫(yī)結合研究會兒科專業(yè)委員會第二屆學術會議制定草案(1999年,廈門)修改。主要指標：(1)食欲不振；(2)大便失調(diào)(包括泄瀉,大便雖成形,次數(shù)增多或大便難解)；(3)面色萎黃少華；(4)形體消瘦(體重低于正常同齡同性別平均值10%)；(5)舌質(zhì)淡,苔薄白。次要指標：(1)肢倦乏力；(2)腹脹；(3)輕度浮腫；(4)輕度貧血；(5)口流清涎；(6)睡時露睛或多汗；(7)脈細弱、無力、指紋淡(3歲以下)。判斷：凡符合主要指標4項或主要指標2項加次要指標1項均可診斷脾虛證。2、脾虛證兒童納入標準：年齡5-12歲兒童,符合上述兒童脾虛證辨證標準。3、排除標準：(1)心、腦、肝、腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病；(2)過敏體質(zhì)、感染性疾病發(fā)病期、精神性疾病；(3)近1個月有使用哮喘、風濕、止痛及精神類藥物者。4、健康兒童納入標準：年齡5-12歲,無明顯的西醫(yī)診斷疾病,中醫(yī)辨證陰陽平和者。1.3.2消瘦和健康兒童選擇考察消瘦兒童檸檬酸刺激前后sAA活性變化分子機制對探討兒童脾虛證本質(zhì)有一定參考價值。在上述收集的全部脾虛證和健康對照兒童病例中,經(jīng)過測量身高(cm)和體重(kg)后,根據(jù)6個大型國際流行病學調(diào)查界定的標準,以體重指數(shù)(body mass index, BMI)將其分為低BMI(消瘦)和正常BMI(健康)兒童；另外,根據(jù)中國肥胖工作組設立的標準排除超重或肥胖兒童。1.4唾液采集與指標測定1.4.1唾液采集兒童唾液采集方法和流程基于本實驗前述成人唾液采集方法學考察結果進行改進。兒童受試者先靜坐10 min,充分休息,采取坐位、頭稍前傾、眼睛睜開的體位,然后通過吞咽的方法將口腔唾液排凈后,讓唾液在口腔匯聚3 min后一次性自然流出,獲得刺激前唾液；緊接著,用含0.4 mol/L檸檬酸、大小為1 cm×1 cm的濾紙,刺激舌尖1 min,然后快速一次性收集檸檬酸刺激后唾液。在酸刺激期間,囑受試者將舌尖抬起以避免檸檬酸進入唾液,影響唾液pH值。1.4.2唾液指標測定唾液流率、pH值及總蛋白測定：唾液流率即為唾液體積(mL)與收集耗時(min)的比值(mL/min);pH精密試紙測定唾液pH值；BCA蛋白測定試劑盒測定唾液總蛋白含量(mg/mL)。sAA活性測定：利用國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯(lián)盟(IFCC)所推薦的EPS-G7速率法,來測定sAA活性(U/mL)。sAA比活(U/mg)=sAA活性(U/mL)/總蛋白含量(mg/mL)。sAA含量測定：通過引進已知含量的人源sAA標準品,利用Western blot (WB)的方法測定檸檬酸刺激前后唾液樣品中糖基化、非糖基化及總sAA的含量(mg/mL)。sAA糖基化水平即糖基化sAA含量占總sAA含量的比例。AMY1基因拷貝數(shù)測定：根據(jù)本實驗前述從唾液中提取基因組DNA方法學考察結果,利用碘化鉀法提取兒童唾液基因組DNA后,對AMY1基因和腫瘤蛋白TP53基因(內(nèi)參基因)進行熒光定量PCR擴增。通過引進已知含14個AMY1基因拷貝數(shù)的DNA標準品,以2“△Ct*14的方法算出待測DNA樣品AMY1基因拷貝數(shù)。1.5統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 5.0進行作圖并統(tǒng)計學分析,計量資料以X±SD表示,刺激前后唾液指標組內(nèi)比較進行配對t檢驗,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,兩組數(shù)據(jù)相關性分析用Pearson相關系數(shù)。PO.05為差異有統(tǒng)計學意義。2.小鼠甜味覺差異與代謝及食欲等生理與行為學指標相關性研究2.1動物倫理、模型及分組倫理：所有動物實驗經(jīng)過賓夕法尼亞大學附屬莫奈爾中心相關倫理委員會審查通過,實驗過程中實驗人員盡最大努力減少動物痛苦。模型：選擇同窩雌雄129.B6-Taslr3同源異基因小鼠,代數(shù)為N17F9,由莫奈爾中心Dr. Bachmanov實驗室培育。該系小鼠是利用129P3/J(129)和C57BL/6ByJ(B6)小鼠雜交后產(chǎn)生F1代,接著F1雜合后代F2再與129回交超過10次培育而成。經(jīng)TaqMan的SNP基因座鑒定分析方法鑒定,該系小鼠含兩種基因型,分別是129/B6-Taslr3雜合小鼠(簡寫：B6/129)和129/129-Taslr3純合小鼠(簡寫：129/129)。雜合小鼠即B6/129除4號染色體有一小段來自B6外,其他與129完全一致,該段染色體含數(shù)個基因,而Taslr3被證實是唯一影響小鼠甜味覺的基因,故兩種基因型小鼠甜味覺有顯著差異,而其他一般生物學特性,如外貌、習性及解剖學等特點并無明顯差異。分組：以129/129純合小鼠為對照組,以含外源性基因的B6/129雜合小鼠為實驗組,兩組小鼠數(shù)量在12只到29只不等。2.2實驗條件動物實驗在美國賓夕法尼亞大學附屬莫奈爾中心Dr. Bachmanov實驗室進行,實驗在溫度為23℃以及12：12小時的光暗周期(上午7：00燈光自動打開直至晚上7：00熄燈)環(huán)境中進行。實驗開始前,新生的性別相同的同窩小鼠飼養(yǎng)于同一小鼠盒子,每個盒子小鼠數(shù)量在1至6只之間不等數(shù)量,飼養(yǎng)至二月大(2-mo)；開始實驗后(2-mo),將同盒的雄性小鼠分開,單獨飼養(yǎng)于獨立的盒子,而雌性小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)于同盒,直至完成全部實驗。另外,小鼠飼料為Teklad Rodent Diet 8604,該飼料含70%左右的淀粉類食物(如玉米淀粉),飲用水為莫奈爾中心提供的去離子水。2.3實驗項目2.3.1糖精喜好實驗本實驗可以確認兩組小鼠的甜味覺差異,為后續(xù)研究甜味覺差異對小鼠生理與行為學影響作鋪墊。在2-mo至6-mo之間,采用經(jīng)典的two-bottle test,測量兩組小鼠對2 mM和10 mM糖精溶液的喜好程度及攝入量,每個濃度糖精溶液測量96小時(去離子水作為第二選擇)。糖精和水的每日攝入量用每30 g小鼠體重表示(mL/30g BW)或以相對百分比表示(%,糖精或水的攝入量／總液體攝入量)。2.3.2糖耐量和胰島素耐量實驗甜味覺差異會引起糖代謝的變化,本實驗可以考察兩組小鼠糖代謝情況。當小鼠2-mmo大時,每只小鼠首先接受腹腔注射的糖耐量實驗(IP GTT),接著是灌胃注射糖耐量實驗(IG GTT),然后是胰島素耐量實驗(ITT),各實驗間隔一周左右以洗脫實驗間相互影響；當小鼠6-mmo大時,進行同樣的實驗。2.3.3 LabMaster分析實驗甜味覺差異可以引起食欲變化,本實驗可以分析兩組小鼠多個生理與行為學指標(含食欲)。分別在2-mo和6-mo對小鼠進行核磁共振(見下述)分析后約一周,利用LabMaster系統(tǒng)對小鼠的能量代謝、活動量、進食及飲水量等進行測量。該系統(tǒng)每隔30 min對小鼠的吸入氧氣量(VO2)、呼出二氧化碳量(VCO2)、呼吸交換率(respiratory exchange ratio, RER)、能量消耗(energy expenditure, EE)、水平和垂直活動量以及飲水和進食量進行測量記錄,連續(xù)記錄5天。其中,RER和EE可以考察小鼠能量代謝情況。實驗結束后,數(shù)據(jù)進行平均化處理,得到24小時(一個晝夜周期)的平均數(shù)據(jù)進行展示。2.3.4體重曲線和身體成分構成分析實驗糖代謝、食欲及能量代謝等差異影響小鼠身體成分構成,分析小鼠體重曲線及身體成分構成有助于深入分析小鼠甜味覺差異的生理病理影響,如脂代謝。體重曲線：小鼠體重分別在2-mo、3-mo、4-mo、5-mo和6-mo時于上午10：00左右進行測量,精確到0.1 g,實驗結束后繪制體重曲線。核磁共振(NMR)：在小鼠分別完成2-mo和6-mmo的ITT后第二天,利用Bruker Minispec LF 110對小鼠進行掃描,分析身體成分構成；雙能X線吸收測量法(DEXA):在6-mo的LabMaster分析實驗后約一周,用吸入C02法將小鼠安樂死,利用Lunar PIXImus Ⅱ densitometer的雙能X線吸收測量法對小鼠身體成分進行分析；解剖：對小鼠進行DEXA后,解剖脂肪組織和內(nèi)臟器官并稱重。2.4統(tǒng)計分析采用Statistica (version 10)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差(X±SD)或均數(shù)±標準誤(X±SE)表示,采用ANOVA或GLM對數(shù)據(jù)進行分析,比較采用post hoc (Fisher LSD test),作圖采用Excel或Statistica, P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結果：1.不同濃度和面積檸檬酸刺激對健康成人唾液分泌的影響同一檸檬酸濃度下(0.2M),與面積為0.5×的濾紙比較,面積為1×和2×的濾紙刺激時和刺激后sAA活性比值均顯著提高(P0.05),而以2×提高更明顯；并且,除0.5×外,1×和2×刺激時和刺激后sAA活性比值均高于1(即酸刺激下sAA活性升高),且刺激后sAA活性比值均顯著高于自身刺激時(P0.05)。另外,與0.5×和1×比較,2×刺激下唾液流率增加較為明顯。同一濾紙面積下(1×),不同濃度檸檬酸(0.1M、0.2M和0.4M)刺激下均能顯著提高sAA活性,但與0.1M或0.2M比較,0.4M刺激時和刺激后sAA活性比值均顯著提高(P0.05)；并且,除0.1M外,0.2M和0.4M刺激后sAA活性比值高于自身刺激時(P0.05)。另外,與0.1M和0.2M比較,0.4M刺激下唾液流率增加較為明顯。研究結果提示,0.2M/2×或0.4M/1×檸檬酸濾紙可以顯著增加成人唾液的分泌和sAA活性,且刺激后sAA活性比值明顯高于刺激時。2.不同保存條件和提取方法對從唾液中提取基因組DNA的影響2.1碘化鉀法與試劑盒法提取新鮮和室溫保存唾液DNA的比較2.1.1基因組DNA的得率和純度從DNA提取的得率(u g)來看,試劑盒法提取新鮮唾液標本獲得的DNA含量最高(2.64±0.34),顯著高于碘化鉀法(P0.05),而試劑盒法提取室溫保存一周的唾液標本獲得的DNA含量最低(0.51±0.11),顯著低于碘化鉀法(P0.05)；碘化鉀法對兩種不同保存方法獲得的DNA含量居中,且差異不大。從提取純度(質(zhì)量)來看,碘化鉀法對新鮮唾液標本提取的DNA的D260/D280值為2.0左右(1.99±0.05),而且對室溫保存樣本獲得DNA的D280/D280值更高(2.20±0.05),而試劑盒法對兩種保存方法獲得的DNA的D260/D280值都在1.8左右,均顯著低于碘化鉀法(P0.05)；另外,碘化鉀法提取的DNA的D260/D230值都明顯低于試劑盒法(P0.05)。研究結果提示,碘化鉀法對兩種不同保存條件下唾液DNA的得率比較穩(wěn)定,但可能也存在少量RNA和鹽離子、糖類物質(zhì)的殘留。2.1.2基因組DNA電泳結果兩種方法對新鮮唾液樣本提取的DNA在23 kb附近都有一條明顯的主帶,但是試劑盒法獲得的DNA拖尾現(xiàn)象明顯,提示DNA存在的降解；兩種方法對于室溫放置7天的唾液標本提取的DNA,都存在一定程度的降解,尤其是試劑盒法獲得DNA樣品降解嚴重,其中一個標本幾乎沒有明顯的主帶。結果提示碘化鉀法對提取兩種不同保存條件下唾液DNA的降解程度較輕。2.1.3基因組DNA體外PCR擴增兩種不同提取方法和保存條件下得到的DNA樣品對TP53(192 bp)和PRB-3(1261bp)基因都有非常好的PCR擴增效果,PCR產(chǎn)物大小與預期一致。2.2碘化鉀法提取-80℃凍存唾液DNA考察碘化鉀法對-80℃凍存唾液標本提取的基因組DNA的得率、純度以及電泳結果都與碘化鉀法提取新鮮唾液標本的結果一致,無明顯差異；另外,其DNA樣品對TP53和PRB-3基因也都有非常好的PCR擴增效果。此外,熒光定量PCR結果顯示,TP53基因有很好的熒光擴增曲線,并且熒光融解曲線只有一個特征峰,提示唾液中微生物和食物殘渣不會干擾人源基因組DNA的PCR擴增。研究結果提示,相對于商業(yè)試劑盒法,碘化鉀法可以快速穩(wěn)定地從不同保存條件下的唾液中提取足量和高質(zhì)量的DNA。3.脾虛證兒童酸刺激前后唾液指標變化3.1一般資料在2013年4月至11月,于廣州市海珠區(qū)婦幼保健院中醫(yī)科,共收集20例脾虛證兒童及29例健康對照組兒童。脾虛證兒童中,男10例、女10例,平均年齡8±2歲；健康對照組兒童中,男15例、女14例,平均年齡7±3歲,兩組兒童的年齡和性別構成無明顯差異(P0.05)。所有參與本研究兒童的父母或監(jiān)護人簽署知情同意書。3.2脾虛證兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標組內(nèi)比較健康兒童組酸刺激前后比較,酸刺激后sAA活性、sAA含量、糖基化sAA含量及非糖基化sAA含量相對于酸刺激前明顯提高(P均0.05)；另外,唾液流率及pH值也顯著提高(P0.05),研究提示健康兒童唾液分泌對檸檬酸刺激反應良好。脾虛證兒童組酸刺激前后比較,酸刺激后只有唾液流率、pH值及sAA糖基化水平顯著提高(P0.05),其余指標如sAA活性等均無明顯提高,提示脾虛證兒童酸負荷下唾液分泌反應減弱。3.3脾虛證兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標組間比較脾虛證兒童酸負荷下sAA活性比值(1.87±1.04)相對于健康兒童(2.72±1.58)明顯降低(P0.05),提示酸負荷下脾虛證兒童sAA活性增加的幅度明顯低于健康兒童,與文獻報道成人脾虛證研究結果類同。脾虛證兒童sAA糖基化水平比值(1.54±0.63)相對于健康兒童(1.20±0.45)則顯著提高(P0.05),提示酸負荷下脾虛證兒童sAA糖基化異常。兩組兒童AMY1基因拷貝數(shù)(脾虛證兒童：8.57±3.21,健康兒童：7.85±2.70)差異無統(tǒng)計學意義(170.05),提示AMY1基因拷貝數(shù)對脾虛證兒童sAA活性比值改變可能無影響。4.消瘦兒童酸刺激前后唾液指標變化4.1一般資料收集的49例兒童中,共有43例兒童受試者納入研究。其中,消瘦組兒童21例,男10例、女11例,平均年齡8±2歲；健康對照組兒童22例,男13例、女9例,平均年齡8±2歲,兩組兒童的年齡和性別構成無明顯差異(P0.05)。4.2消瘦兒童與健康兒童酸刺激前后唾液指標組間比較兩組兒童刺激前后sAA含量和活性均無顯著差異(P0.05)。然而,消瘦兒童的sAA活性比值(1.6±0.8)相對于健康兒童(2.3±1.0)明顯降低(P0.05)；并且,消瘦兒童的sAA含量比值(1.1±0.7)相對于健康兒童(2.0±1.2)也顯著降低(P0.05),提示消瘦兒童酸負荷下的sAA分泌反應低下,與脾虛證兒童研究結果類似。另外,健康和消瘦兒童AMY1基因拷貝數(shù)平均值分別為7.6±2.7和8.0±2.1,兩組兒童AMY1基因拷貝數(shù)并無顯著差異(P0.05),結果提示AMY1基因拷貝數(shù)對消瘦兒童sAA活性比值改變可能無影響。5.甜味覺差異對小鼠糖代謝及食欲等的影響5.1 B6/129和129/129小鼠甜味覺差異B6/129小鼠對2 mM糖精溶液的攝入量(7.3±0.6 ml/30 g BW)及喜好程度(91.9±1.1%)相對于129/129小鼠的攝入量(4.6±0.2 ml/30 g BW)和喜好程度(71.3±2.8%)均明顯提高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；對于更高濃度糖精溶液(10mM),B6/129小鼠的攝入量(14.1±2.2 ml/30 g BW)相對于129/129小鼠(7.8±0.6 ml/30 g BW)也明顯提高(P0.05),結果提示含來源于B6的Taslr3等位基因小鼠即B6/129雜合小鼠,甜味覺病理性過高。5.2 B6/129和129/129小鼠糖代謝比較5.2.1糖耐量實驗腹腔注射葡萄糖后,6-mo時基因型效應對小鼠血糖代謝的影響是顯著的(P0.05), post hoc比較發(fā)現(xiàn)雄性B6/129小鼠血糖在5min、45min、60 min以及90 min時均顯著高于雄性129/129小鼠(P0.05),結果表明腹腔注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對受損。灌胃注射后,2-mo時雄性B6/129小鼠血糖水平在灌胃注射后15 min、30 min和45 min均顯著高于129/129小鼠(P0.05)；并且,6-mo時雄性B6/129小鼠在灌胃后30 min的血糖水平也顯著高于129/129小鼠(P0.05),結果表明灌胃注射葡萄糖后B6/129小鼠血糖代謝相對受損。相對129/129小鼠,含外源性基因的B6/129小鼠腹腔及灌胃注射糖耐量均受損,符合脾虛證糖耐量異常或受損的特征。5.2.2胰島素耐量實驗注射胰島素后,兩組小鼠血糖水平開始急劇下降,并于60 min左右達到最低水平,之后開始緩慢上升,然而,小鼠血糖在120 min實驗時間內(nèi)并未恢復到基礎值。本研究并未發(fā)現(xiàn)顯著的基因型效應(P0.05),結果提示兩組小鼠對胰島素敏感性相似。5.3 B6/129和129/129小鼠LabMaster比較5.3.1進食量和飲水量分析基因型效應對小鼠進食量的影響接近顯著(P=0.059), post hoc比較顯示：2-mo時,129/129小鼠在21：00、08：00和11：00三個時間點的進食量顯著高于B6/129小鼠(P0.05)；6-mo時,129/129小鼠在17：00(P=0.082)和18：00(P=0.070)兩個時間點的進食量可能高于B6/129小鼠。研究提示,相對于129/129小鼠,B6/129小鼠的平均進食量可能更低。基因型效應對小鼠飲水量的影響是顯著的(P0.05), post hoc比較顯示：2-mo時,129/129小鼠在21：00和12：00兩個時間點的飲水量顯著高于B6/129小鼠(P0.05),而6-mo時,129/129小鼠在20：00和23：00兩個時間點的飲水量也顯著高于B6/129小鼠(P0.05)。可見,相對于129/129小鼠,B6/129小鼠的平均飲水量顯著降低。結果提示,B6/129小鼠進食和飲水量顯著降低,進一步推測其更符合脾虛證特征。5.3.2呼吸交換率(RER)和能量消耗(EE)分析2-mo時,post hoc顯示雄性129/129小鼠在11：00、12：00、13：00、14：00和15：00五個時間點的RER均顯著高于雄性B6/129小鼠(K0.05)；6-mo時,雌性129/129小鼠在00：00、03：00和04：00三個時間點的RER均顯著高于雌性B6/129小鼠(K0.05),并且,雄性129/129小鼠在14：00和15：00兩個時間點的RER也顯著高于雄性B6/129小鼠(P0.05)�？梢�,相對于129/129小鼠,B6/129的RER顯著降低�；蛐托獙π∈蟮腅E有顯著的影響,即129/129小鼠的能量消耗顯著高于同年齡B6/129小鼠(P0.05)。隨著時間推移,129/129小鼠(特別是雌性)EE下降明顯,而B6/129小鼠則相對穩(wěn)定。可見,相對于129/129小鼠,B6/129小鼠EE水平較低,但相對穩(wěn)定。結果提示,B6/129的RER及EE顯著降低,能量代謝可能異常,符合脾虛證特征。5.3.3活動量分析基因型效應對小鼠活動量的影響是顯著的(P0.05),post hoc比較顯示B6/129小鼠在22：00、00：00、01：00和04：00四個時間點的活動量顯著高于129/129小鼠(P0.05)。可見,相對于129/129小鼠,B6/129小鼠平均活動量更大。5.4 B6/129和129/129小鼠體重曲線和身體成分構成比較5.4.1體重曲線本研究并未發(fā)現(xiàn)兩組小鼠體重增長有明顯差異(P=0.564)。5.4.2身體成分構成分析核磁共振(NMR)分析：年齡和基因型交互作用對小鼠脂肪含量有顯著影響(K0.05)。2-mmo時,B6/129小鼠脂肪含量高于129/129小鼠,隨著時間推移,B6/129小鼠脂肪含量下降更明顯,以致6-mo時,其脂肪含量卻低于同年齡129/129小鼠。研究提示,相對129/129小鼠,B6/129小鼠脂肪含量可能更高,但隨著時間推移下降相對明顯。雙能X線吸收測量法(DEXA)分析：GLM分析并未發(fā)現(xiàn)兩組小鼠各DEXA指標有明顯差異,但B6/129小鼠的脂肪含量有高于129/129小鼠的趨勢。解剖分析： GLM分析顯示,基因型效應對小鼠棕色脂肪含量有顯著的影響,即B6/129小鼠的棕色脂肪含量顯著高于129/129小鼠(必0.05)。結果提示,雖然兩組小鼠體重增長無顯著差異,但就脂肪含量來說,B6/129小鼠可能更高,特別是棕色脂肪含量,即B6/129小鼠脂代謝可能異常,亦符合脾虛證特征。結論：脾虛證兒童研究表明,患兒酸刺激后sAA活性比值下降,并伴有sAA糖基化水平異常升高,而AMY1基因拷貝數(shù)無顯著變化,結果提示酸刺激后sAA活性比值測定可作為兒童脾虛證臨床診斷客觀參考指標之一,而sAA活性比值下降可能與其糖基化調(diào)控機制有關。消瘦兒童獲得與脾虛證兒童研究的類似結果,提示脾虛是兒童消瘦的發(fā)病機制之一,同時也說明消瘦作為脾虛證的證候診斷指標之一是有科學依據(jù)的。小鼠實驗研究表明,Taslr3同源異基因的B6/129小鼠甜味覺病理性過高,類似《內(nèi)經(jīng)》“有病口甘者”,出現(xiàn)糖脂代謝異常、食欲下降及能量代謝紊亂等現(xiàn)象,提示B6/129小鼠有應用于作為類脾虛證小鼠模型進行研究的可能,脾虛證可能存在“甜味覺-糖脂代謝”異常的發(fā)病機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R272

【參考文獻】

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1 中國肥胖問題工作組 ,季成葉;中國學齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類標準[J];中華流行病學雜志;2004年02期

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本文編號：1724730