本文選題：類風濕關節(jié)炎　切入點：清熱活血方　出處：《中國中醫(yī)科學院》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：觀察清熱活血方對膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)大鼠關節(jié)滑膜血管新生的影響,及體外對類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(RA-FLS)和臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖、遷移、黏附和管腔形成的影響,并通過PI3K/Akt通路探索相關作用機制,為清熱活血方在臨床治療類風濕關節(jié)炎提供實驗依據(jù)。方法：將健康雌性SD大鼠稱重后隨機分為6組：正常組,模型組,清熱活血方低、中、高組(15、20、25g生藥/kg),抑制劑Ⅰ.Y294002組(20mg/kg),采用Ⅱ型膠原乳化劑在大鼠尾根部皮下注射,在第7天于相同部位注射等量Ⅱ型膠原乳化劑以加強免疫,建立CIA模型。免疫第10天開始灌胃給藥,正常組和模型組予等量生理鹽水。連續(xù)給藥28天,并在過程中觀察并記錄各組大鼠體重變化、關節(jié)癥狀和腫脹度；各組大鼠腹主動脈取血于離心管,離心收集血清,用ELISA法測定各組大鼠血清中促炎癥因子白介素-1β (IL-1β)和促血管新生血管生長因子(VEGF)的表達；Western Blot法檢測踝關節(jié)組織中PI3K/Akt信號轉導通路相關蛋白PI3K、p-Akt、PTEN的表達；Real-time PCR檢測滑膜組織中胎盤生長因子(PLGF)及其受體Flt1、Flk1和PI3K/Akt通路負調控基因PTEN的mRNA水平表達。取RA患者膝關節(jié)滑膜組織,采用組織貼壁法分離人類原代RA-FLS,傳代培養(yǎng),第3-6代細胞用于實驗；同時培養(yǎng)HUVEC進行實驗。清熱活血方低、中、高濃度(20、100、500ng生藥/mL)與TNF-a誘導的RA-FLS和VEGF165誘導的HUVEC共孵育,并設置空白對照組,采用MTS法檢測細胞增殖活性；通過劃痕實驗觀察細胞的遷移作用；用細胞外基質的主要成分之一纖連蛋白(FN)包被培養(yǎng)板,觀察細胞對FN黏附的變化；采用基質膠包被培養(yǎng)板,觀察HUVEC的管腔形成能力；ELISA法測定RA-FLS分泌的IL-1β、VEGF、PLGF及其受體Flt1、Flk1的表達；Western Blot檢測PI3K/Akt通路相關蛋白水平的表達。結果：1.清熱活血方對CIA大鼠關節(jié)炎癥狀、關節(jié)腫脹度和體重的影響模型組與正常組相比,大鼠關節(jié)紅腫明顯,后足腫脹度顯著增加(P0.001),與模型組相比,清熱活血方可呈劑量依賴性減輕關節(jié)紅腫的癥狀,且中、高劑量(20、25g/kg)可顯著降低關節(jié)腫脹度(P0.05), LY294002亦可明顯緩解后足腫脹度(P0.05)。與正常組相比,模型組體重增長緩慢,清熱活血方與模型組相比,能呈劑量依賴性地促進CIA大鼠體重的增加,高劑量(25g/kg)組與LY294002組在免疫第21天起體重增加明顯(P0.05)。2.清熱活血方對CIA大鼠血清IL-1β、VEGF表達的影響給藥28天后,與正常組相比,模型組血清IL-1β、VEGF的含量顯著升高(P0.01),與模型組相比,清熱活血方可不同程度地降低IL-1β、VEGF的含量,呈劑量相關性,高劑量(25g/kg)能明顯降低IL-1β、VEGF的含量(P0.05),LY294002組IL-1p明顯下降(P0.05)。3.清熱活血方對CIA大鼠踝關節(jié)組織中PI3K/Akt通路蛋白表達的影響給藥28天后,模型組相較正常組,組織中P13K蛋白表達和Akt磷酸化水平顯著升高(P0.001),清熱活血方治療后可呈劑量依賴性下調PI3K、p-Akt蛋白的表達(P0.01,P0.001)。模型組的PTEN蛋白表達較正常組顯著下調(P0.001),清熱活血方中、高劑量(20、25g/kg)能明顯上調PTEN的表達(P0.05, P0.001), LY294002能顯著抑制PI3K、p-Akt并促進PTEN的表達(P0.001)。4.清熱活血方對CIA大鼠膝關節(jié)滑膜組織中PLGF、Flt1、Flk1及PTEN mRNA表達的影響給藥28天后,模型組的PLGF、Flk1、Fit1mRNA的表達水平較正常組顯著升高(P0.01),與模型組相比,清熱活血方20、25g/kg給藥劑量處可明顯下調表達水平(P0.05,P0.01)。與正常組相比,模型組PTENmRNA的表達顯著降低(P0.001),清熱活血方25g/kg能顯著升高PTEN mRNA表達(P0.001)。LY294002均能顯著下調PLGF、Flk1、Flt1,上調P TENmRNA水平的表達(P0.01,P0.001)。5.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC增殖活性的影響與空白對照組比較,TNF-a可明顯提高RA-FLS的增殖活性(P0.05),清熱活血方可呈濃度依賴性抑制RA-FLS增殖,在25、12.5μg/mL有顯著性差異(P0.05),與空白對照組相比,VEGF誘導能明顯促進HUVEC增殖(P0.05),清熱活血方可抑制HUVEC的增殖活性,在12.5μg/mL濃度處差異有顯著性(P0.05)。6.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC遷移的影響RA-FLS劃痕后24h與Oh相比,空白對照組劃痕區(qū)域可見少量細胞生長,TNF-a誘導促進RA-FLS遷移作用增強(P0.001)；與TNF-a組比較,清熱活血方能減弱顯著RA-FLS向劃痕區(qū)域遷移(P0.01,P0.001),并且呈現(xiàn)量效相關性。HUVEC劃痕后24h與Oh相比,空白對照組有少量細胞向劃痕區(qū)域遷移,VEGF誘導促進HUVEC遷移作用顯著增強(P0.001),清熱活血方處理與VEGF組相比,可呈劑量依賴性抑制HUVEC向劃痕區(qū)域遷移(P0.001)。7.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC黏附的影響與1%BSA陰性對照相比,RA-FLS對FN有較強的黏附能力(P0.001),TNF-α誘導可顯著增加RA-FLS對FN的黏附(P0.001)；清熱活血方可呈劑量依賴地抑制其黏附能力(P0.001)。HUVEC與陰性對照相比,對FN黏附能力較強(P0.001),VEGF誘導能顯著促進HUVEC對FN的黏附(P0.001)；清熱活血肪能抑制其黏附作用(P0.001),并呈劑量相關性。8.清熱活血方對HUVEC管腔形成的影響與空白對照組相比,VEGF誘導能明顯促進HUVEC在基質膠上形成管腔的能力(P0.001),清熱活血方隨濃度的增大可顯著抑制HUVEC的管腔形成(P0.05,P0.001),并呈劑量依賴性。9.清熱活血方對RA-FLS 和 HUVEC中血管新生相關因子含量的影響與空白對照組相比,TNF-a誘導可顯著增加RA-FLS培養(yǎng)上清中IL-1β、VEGF.PLGF的含量(P0.01),清熱活血方5OOng/m L組可明顯降低上清中IL-1p、PLGF勺含量(P0.05),在100、500ng/mL濃度組能顯著減少VEGF的含量(P0.05,P0.01)。VEGF誘導能顯著促進HUVEC中V EGFR1、VEGFR2的含量增加(P0.01),清熱活血方100ng/mL可明顯降低其含量(P0.05)。10.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC中PI3K/A kt通路蛋白表達的影響與空白對照組相比,TNF-α可顯著促進RA-FLS中 PI3K蛋白的表達和Akt的磷酸化(P0.001),清熱活血方能呈劑量依賴性降低P13K、p-Akt的表達(P0.001),加入LY294002亦能顯著抑制TNF-α誘導的RA-FLS中PI3K、p-Akt表達。同時,VEGF誘導相比于空白對照組,PI3K、p-Akt的蛋白表達明顯升高,(P0.001),清熱活血方能不同程度地抑制其表達(P0.001),LY294002亦可顯著抑制VEGF誘導HUVEC中PI3K、p-Akt的蛋白表達水平升高。結論：1.清熱活血方灌胃治療可減輕CIA大鼠關節(jié)紅腫癥狀,降低關節(jié)腫脹度,并能劑量依賴性地降低血清中促炎因子IL-1β和促血管新生因子VEGF的含量,下調滑膜組織中PLGF、Flt1、Flk1mRNA的表達水平,從而改善CIA大鼠臨床癥狀、減輕滑膜炎癥、抑制新生血管的形成,延緩關節(jié)炎的進展。2.清熱活血方能顯著抑制RA-FLS的增殖、遷移、黏附以及促炎因子IL-1β和促血管生長因子VEGF、PLGF的含量,與對HUVEC增殖、遷移、黏附、管腔形成及Flt1、Flk1含量的抑制協(xié)同作用,抑制血管新生的發(fā)生。3.清熱活血方可呈劑量依賴地下調CIA大鼠及RA-FLS和HUVEC細胞中PI3K、p-Akt蛋白的表達,上調CIA大鼠負調控基因PTEN的蛋白和mRNA水平的表達,提示清熱活血方可能通過PI3K/Akt通路調控細胞增殖、遷移、黏附等作用及血管新生相關因子的表達,抑制滑膜新血管的形成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R259

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本文編號：1613091