本文關鍵詞： 類風濕關節(jié)炎 血小板微粒 細胞因子 新風膠囊　出處：《安徽中醫(yī)藥大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：1目的本研究分別從臨床與動物實驗兩個方面觀察類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)、細胞因子及相關實驗指標的變化,評價新風膠囊(Xinfeng Capsule,XFC)對其的影響,探討XFC干預PMPs表達的作用機制。2方法2.1實驗研究將72只清潔級雄性SD大鼠隨機分為正常對照(Normal control,NC)組、模型對照(Model control,MC)組、新風膠囊高劑量(Xinfeng Capsule High Dose,XFCH)組、新風膠囊中劑量(Xinfeng Capsule Medium Dose,XFCM)組、新風膠囊低劑量(Xinfeng Capsule Low Dose,XFCL)組、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)組,每組12只。MC、XFCL、XFCM、XFCH、MTX組大鼠右后足跖皮內(nèi)均注射弗氏完全佐劑0.1ml致炎,復制佐劑關節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠的模型。致炎后第19天開始灌胃給藥,劑量按照各種實驗動物間單位體表面積的用藥量相等的原則進行藥物換算,連續(xù)給藥30天。觀察各組大鼠足趾關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index,AI),酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測各組大鼠血清中白介素(interleukin,IL)-1、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平,流式細胞分析技術檢測PMP標志物CD61、CD41雙陽性的表達情況,超微電鏡觀察血小板超微結構的變化,光鏡觀察各組大鼠足趾關節(jié)滑膜組織的變化,蛋白免疫印跡技術(Western Blotting,WB)檢測各組大鼠腹主動脈中PI3K及AKT的表達變化及XFC對以上指標的影響。2.2臨床研究所選60例RA患者均來自2014年7月至2015年7月安徽省中醫(yī)院風濕免疫科的住院病人,且符合1987年ACR修訂的RA分類標準和2009年ACR/EULAR提出的RA分類標準和評分系統(tǒng),中醫(yī)診斷標準符合衛(wèi)生部頒布的《中藥新藥治療痹病的臨床指導原則》。將60例RA患者隨機分組為XFC組、MTX組、MTX+XFC組各20例。另設20例正常對照者。采用生化分析儀檢測基礎生化指標及血常規(guī),ELISA檢測血清IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、VEGF的含量,流式細胞術檢測PMPs標志物CD61、CD41雙陽性的表達情況,問卷量表的方法來觀察RA患者的生活質量變化及焦慮抑郁情緒的改變,觀察XFC對RA患者的療效、PMPs及細胞因子水平等相關實驗室指標的影響。3結果3.1實驗研究結果3.1.1 AA大鼠體質量、足趾腫脹度和AI變化及XFC對其影響造模前各組大鼠體質量、足跖腫脹度及AI比較無統(tǒng)計學意義。致炎后第19日給藥,與NC組比較,MC、XFCL、XFCM、XFCH、MTX組大鼠足趾腫脹度和AI均顯著升高(P0.01),MC組與各治療組之間比較無差異(P0.05)。連續(xù)給藥30天后,與NC組比較,MC組與各治療組大鼠足趾腫脹度和AI仍升高,體重降低,(P0.01或P0.05);與MC組比較,各治療組大鼠足跖腫脹度和AI明顯降低,體重增加,(P0.05或P0.01);與MTX組相比,XFCM組體量有所增加,足趾腫脹度與AI降低,但差異無統(tǒng)計學意義。3.1.2 AA大鼠關節(jié)病理形態(tài)學變化及XFC對其影響光鏡下觀察各組AA大鼠的足趾關節(jié)HE染色病理切片:NC組大鼠的滑膜組織結構清晰,未見增生、突起,無炎細胞浸潤,細胞排列規(guī)則,分層較少,關節(jié)軟骨及骨結構完整;MC組大鼠關節(jié)滑膜中可見大量的炎性細胞浸潤,明顯的滑膜組織增生及滑膜血管翳形成,滑膜襯細胞分層增多,關節(jié)面模糊,部分關節(jié)軟骨表面毛糙或缺如;XFCM組大鼠關節(jié)滑膜、血管壁可見少量炎細胞浸潤,滑膜組織結構較MC明顯改善,增生程度減輕,關節(jié)面較規(guī)整;與XFCM組比較,MTX組大鼠關節(jié)滑膜襯細胞增厚,部分關節(jié)軟骨可見血管翳形成,關節(jié)面欠規(guī)整;XFCL和XFCH組大鼠關節(jié)可見炎性細胞浸潤于滑膜及其周圍組織,滑膜血管翳增生,滑膜襯細胞增厚,關節(jié)面較模糊,有關節(jié)軟骨及骨破壞。3.1.3 AA大鼠血清PMPs陽性表達率的變化及XFC對其影響與NC組比較,MC、MTX、XFCL、XFCH組PMPs均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),XFCM組PMPs略有升高,但差異無統(tǒng)計學意義;與MC組比較,MTX、XFCL、XFCM、XFCH組PMPs均顯著下降(P0.01);與MTX組比較,XFCM組PMPs降低(P0.05),而XFCL、XFCH組無統(tǒng)計學差異。3.1.4 AA大鼠血清細胞因子IL-6、IL-10、VEGF水平的變化及XFC對其影響與NC組比較,MC、XFCL、XFCH、MTX組IL-6、VEGF均明顯升高、IL-10明顯降低(P0.01),XFCM組IL-6升高、IL-10降低(P0.01),VEGF有所升高,但差異無統(tǒng)計學意義;與MC組相比,XFCL、XFCM、XFCH、MTX組IL-6、VEGF明顯降低、IL-10顯著升高(P0.05或P0.01);與MTX組比較,XFCM組VEGF明顯降低(P0.05)。3.1.5 AA大鼠腹主動脈組織PI3K、AKT的表達變化及XFC的影響在大鼠腹主動脈組織中,與NC組比較,MC、MTX、XFCL、XFCM、XFCH組PI3K、AKT均明顯上升(P0.01);與MC組比較,MTX、XFCL、XFCM、XFCH組PI3K、AKT均明顯降低(P0.01);與MTX組比較,XFCL、XFCM、XFCH組PI3K明顯上升(P0.01),AKT升高(P0.01或P0.05)。3.1.6 AA大鼠PLT超微結構變化及XFC對其影響電鏡下可見:NC組血小板呈橢圓形、表面光滑,偽足少見,胞質內(nèi)可見散在的α顆粒、線粒體及囊泡狀開放的管道系統(tǒng);MC組血小板伸出偽足,部分脫落形成囊泡狀PMPs,胞質結構明顯損傷,胞質內(nèi)α顆粒、線粒體減少;MTX組血小板偽足突起較MC組減少,α顆粒、線粒體較MC組增多,部分胖脹、空泡樣變;XFCL組血小板有較多偽足突起,α顆粒、線粒體較MC組增多,較MTX組減少,部分腫脹、空泡樣變;XFCM組血小板無偽足,基本保存橢圓形結構,α顆粒、線粒體明顯較MTX組增多,少數(shù)空泡化;XFCH組血小板有少許偽足突起,α顆粒、線粒體明顯增多。3.2臨床研究結果3.2.1 RA患者PMPs、細胞因子的變化及相關性研究共檢測20例NC組及60例RA組的PMPs陽性表達率、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、VEGF水平,與NC組比較,RA組的PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF水平均有明顯升高,IL-4和IL-10明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義;相關性分析顯示,PMPs與IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF呈正相關,與IL4、IL-10呈負相關。3.2.2 RA患者PMPs、細胞因子與相關實驗室指標的相關性研究相關性分析顯示,PMPs與ESR、CRP、PLT均呈正相關,IL-1、TNF-α與ESR呈正相關,IL-6、VEGF與CRP呈正相關;關節(jié)疼痛、關節(jié)腫脹、關節(jié)壓痛與PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α均呈正相關與IL-4呈負相關(P0.05或P0.01);關節(jié)腫脹與IL-10呈負相關,晨僵與PMPs、IL-1、IL-6、呈正相關;生活質量總積分與PMPs、IL-1、TNF-α呈正相關(P0.05);DAS28與PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α呈正相關,與IL-10呈負相關。3.2.3三組病例臨床療效比較ACR20/50/70卡方檢驗P值0.05,說明三組間的差異不具有統(tǒng)計學意義;但由表中的數(shù)值可以看出,MTX+XFC組的療效要略優(yōu)于MTX組和XFC組。3.2.4三組RA病例治療前后PMPs與細胞因子的變化情況與治療前相比,三組藥物治療后PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF均明顯降低(P0.05或(P0.01),IL-4、IL-10顯著升高(P0.05或P0.01);治療后,與MTX組相比,MTX+XFC組PMPs、IL-6、TNF-α降低(P0.01);IL-4、IL-10升高(P0.05或(P0.01),XFC組IL-1、VEGF有所升高(P0.05或P0.01)。3.2.5三組RA病例治療前后相關實驗室指標變化情況與治療前比較,三組藥物治療后ESR、CRP、PLT均明顯降低(P0.05或P0.01),中醫(yī)癥候體征積分各項及總積分、生活質量積分各項、HAQ、DAS28、SAS、SDS均有明顯降低(P0.05或P0.01);治療后,與MTX組比較,MTX+XFC組CRP降低更明顯(P0.05),治療后關節(jié)疼痛、腫脹、少氣懶言、食欲減退明顯改善(P0.05),AQT、社會功能、心理功能、健康自我認識能力均有所改善(P0.05或P0.01),HAQ、DAS28、SDS明顯降低(P0.05),XFC組少氣懶言、食欲減退降低(P0.05)。4結論4.1 AA大鼠會出現(xiàn)體質量下降以及類似RA的關節(jié)炎癥的表現(xiàn)和病理結構,而XFC能改善大鼠的關節(jié)炎癥表現(xiàn)及滑膜的病理結構,降低滑膜炎癥,抑制血管翳增生,且對大鼠生長無不良影響。4.2 AA大鼠體內(nèi)確實存在PMPs的釋放和PLT活化,而XFC能抑制AA大鼠體內(nèi)PMPs的釋放和PLT活化,且中劑量的XFC作用優(yōu)于MTX。4.3 AA大鼠體內(nèi)存在促炎因子和血管活性因子的升高以及抑炎因子的降低,而XFC可以通過平衡細胞因子網(wǎng)絡發(fā)揮抑制炎癥發(fā)應和滑膜血管新生的作用,且中劑量XFC的效果更加明顯。4.4 AA大鼠體內(nèi)存在PI3K/Akt信號通路的上調(diào),而XFC可以有效的調(diào)節(jié)AA大鼠腹主動脈組織中PI3K/Akt信號通路水平,且作用優(yōu)于MTX。4.5 PMPs可通過促進關節(jié)滑膜炎癥反應以及滑膜血管翳的形成,從而在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。4.6 XFC可通過下調(diào)PI3K/Akt通路,降低PMPs陽性表達率,維持細胞因子網(wǎng)絡的平衡,從而改善RA滑膜炎癥和血管翳增生,達到治療RA的目的。4.7 RA患者體內(nèi)存在PMPs的釋放,其中促炎因子和血管活性因子的升高以及抑炎因子的降低與PMPs的釋放有關。4.8 PMPs與RA患者的疾病活動度及關節(jié)癥狀呈正比。4.9 XFC能顯著抑制RA患者體內(nèi)PMPs的釋放。4.10 XFC能夠顯著提高RA患者外周血中抑炎因子,降低促炎因子和血管活性因子的表達。4.11 XFC能明顯緩解RA患者的疾病活動度,改善局部和全身癥狀、生活質量以及精神狀態(tài);且在改善少氣懶言、食欲減退方面優(yōu)于MTX。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R259

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