本文關(guān)鍵詞： “補(bǔ)腎活血舒筋方” BMSCs 遷移 NF-κB CXCR4　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：頸腰痛是骨傷科臨床最常見的疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)80%的人一生中會(huì)為此就診。椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration, IVDD)是頸腰痛發(fā)病重要的病理因素,但退變的機(jī)理目前還不十分明確,有關(guān)椎間盤退變的機(jī)理及減緩椎間盤退變的方法是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。研究目的由于椎間盤缺乏血管且細(xì)胞數(shù)量少,其本身幾乎不能自我修復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)治療,可以促進(jìn)椎間盤組織的再生。由于BMSCs的來源有限及植入問題,促進(jìn)內(nèi)源性BSMDs歸巢成為一種新的選擇。臨床研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用“補(bǔ)腎活血舒筋方”治療頸腰痛療效顯著,既往實(shí)驗(yàn)證明,“補(bǔ)腎活血舒筋方”可以通過調(diào)節(jié)核因子(Nuclear factor-κB,NF-κB)抑制炎癥反應(yīng)和椎間盤退變的發(fā)展。因此,我們提出假說,“補(bǔ)腎活血舒筋方”通過調(diào)節(jié)NF-κB/CXCR4促進(jìn)BMSCs歸巢至退變的椎間盤,進(jìn)而修復(fù)退變的椎間盤,達(dá)到治療頸腰痛的目的。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察“補(bǔ)腎活血舒筋方”對(duì)大鼠BMSCs增殖、遷移及NF-κB、CXCR4表達(dá)的影響,并初步探討B(tài)MSCs遷移的可能機(jī)制。研究方法取4周齡SPF級(jí)SD大鼠,分離其后肢股骨,采用全骨髓貼壁法分離并提取大鼠BMSCs,放置于含有預(yù)熱的培養(yǎng)基及10%胎牛血清的T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。取培養(yǎng)純化至第3代后的BMSCs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)分化,并用油紅O及茜素紅染色鑒定分化后的細(xì)胞。制備“補(bǔ)腎活血舒筋方”中藥原液,取20只成年SD大鼠隨機(jī)分成四組,高、中、低中藥血清組分別灌服高、中、低濃度中藥原液,對(duì)照組灌服等體積雙蒸水,制備高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清,采用中藥化學(xué)指紋圖譜對(duì)中藥原液及含藥血清進(jìn)行質(zhì)量控制。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預(yù)培養(yǎng)24h,應(yīng)用Cell CountingKit-8(CCK-8)法檢測各組BMSCs的增殖情況。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預(yù)培養(yǎng)48h,應(yīng)用transwell小室觀察不同濃度含藥血清作用后BMSCs的遷移情況。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預(yù)培養(yǎng)48h,應(yīng)用Western Bloting檢測NF-κB、CXCR4蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定：全骨髓貼壁方法所獲得的BMSCs培養(yǎng)5-7日即可傳代,傳代后增殖速度較原代明顯增快,3d左右可融合達(dá)80%。第3至第5代細(xì)胞純化程度高,細(xì)胞增殖能力強(qiáng);傳代后培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形或多角形,細(xì)胞數(shù)目多、排列緊密時(shí)可呈漩渦狀排列。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs,每三天可觀察到改變,誘導(dǎo)結(jié)束后觀察到細(xì)胞內(nèi)被油紅O染紅的脂滴；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs,每三天可觀察到改變,誘導(dǎo)14天后培養(yǎng)基內(nèi)可見能夠被茜素紅染色的鈣結(jié)節(jié)。2、“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清的制備：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)儀在中藥原液中檢測到12種有效成分,其中7種入血,血清樣品中以阿魏酸(川芎、當(dāng)歸)、川續(xù)斷皂苷(續(xù)斷)、原兒茶酸(狗脊)含量最高,含藥血清中者三種有效成分含量具有濃度梯度差。3、“補(bǔ)腎活血舒筋方”對(duì)BMSCs增殖及遷移的影響：CCK-8結(jié)果顯示,各濃度含藥血清組細(xì)胞生存率與對(duì)照組有明顯區(qū)別,P0.05,但是各濃度含藥血清組之間差異不顯著,P0.05。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與BMSCs干預(yù)培養(yǎng)48h后,倒置相差顯微鏡下觀察各組上室下側(cè)均可見細(xì)胞,說明BMSCs存在遷移行為。其中,與對(duì)照組比較,低濃度含藥血清組遷移數(shù)目增多,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。中、高濃度含藥血清組遷移細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中高濃度含藥血清組遷移細(xì)胞數(shù)最多。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、“補(bǔ)腎活血舒筋方”對(duì)NF-κB、CXCR4蛋白表達(dá)的影響：Western bloting結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組κB、CXCR4蛋白均有表達(dá),與對(duì)照組比較,高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血組κB、CXCR4蛋白表達(dá)量增高明顯(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論“補(bǔ)腎活血舒筋方”可促進(jìn)大鼠BMSCs NF-κB、CXCR4蛋白的表達(dá)。說明“補(bǔ)腎活血舒筋方”可能通過提高NF-κB、CXCR4的表達(dá)促進(jìn)BMSCs的遷移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R274.9

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本文編號(hào)：1474046