本文關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎活血湯對(duì)髕骨骨折術(shù)后的影響及MSCs遷移的分子機(jī)制的研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:結(jié)合目前最新文獻(xiàn)研究進(jìn)展,同時(shí)通過臨床觀察補(bǔ)腎活血湯對(duì)"腎虛血瘀"髕骨骨折術(shù)后的臨床療效,和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索骨折愈合過程中MSCs遷移的分子機(jī)制,從而探討補(bǔ)腎活血湯促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理,為中醫(yī)藥促進(jìn)骨折修復(fù)與骨重建提供新思路和藥理靶點(diǎn),以此豐富"腎主骨生髓"和"活血祛瘀生新"等中醫(yī)理論。方法:一、文獻(xiàn)研究歸納、總結(jié)髕骨骨折的治療進(jìn)展,特別是對(duì)手術(shù)治療內(nèi)固定術(shù)的利弊點(diǎn)進(jìn)行分析。聯(lián)系中醫(yī)藥治療方法干預(yù)骨折愈合的臨床報(bào)道,分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)遷移與骨折愈合、補(bǔ)腎活血法關(guān)系,及其內(nèi)在微環(huán)境(趨化因子、信號(hào)通路)的分子機(jī)理。二、臨床研究隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)60例行克氏針張力帶內(nèi)固定的老年髕骨骨折術(shù)后的患者,分為治療組和對(duì)照組。其中,治療組33例為術(shù)后連續(xù)服用補(bǔ)腎活血湯2周,而對(duì)照組不服用中藥,基本處理與治療組一致。利用視覺模擬法(Visual Analog Scale,VAS)記錄兩組治療前后的疼痛評(píng)分,定期復(fù)查X-ray確定兩組骨折愈合時(shí)間,骨折愈合后采用Bostman評(píng)分法評(píng)估兩組的膝關(guān)節(jié)功能。三、實(shí)驗(yàn)研究(一)、補(bǔ)腎活血湯提取物對(duì)大鼠BMSCs體外遷移及CCR2蛋白表達(dá)的影響索氏提取法分別提取補(bǔ)腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物。BMSCs采用全骨髓貼壁法培養(yǎng),P3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)腎活血湯四種提取物按照10,50,100μg/mL對(duì)BMSCs進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn),篩選遷移活性部位。免疫蛋白印跡法(Western blot)和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)活性部位干預(yù)BMSCs表達(dá)CCR2蛋白量。(二)、補(bǔ)腎活血湯活性部位對(duì)大鼠BMSCs表達(dá)Wnt5a的影響Western blot檢測(cè)補(bǔ)腎活血湯活性部位10,50,100μg/mL濃度組的Wnt5a蛋白表達(dá),并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)觀察各組 Wnt5a mRNA 表達(dá)。(三)、Wnt5a基因沉默大鼠BMSCs及其遷移活性的研究RT-qPCR觀察Wnt5a-RNAi慢病毒載體和陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后的Wnt5a mmRNA表達(dá)情況,鏡下觀察各組綠色熒光表達(dá)量。Western blot檢測(cè)各組Wnt5a蛋白表達(dá)及其Transwell實(shí)驗(yàn)觀察各組遷移細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果:一、文獻(xiàn)研究髕骨骨折的內(nèi)固定術(shù)有其利弊,但是均能達(dá)到全面恢復(fù)髕骨功能的作用,而結(jié)合補(bǔ)腎活血法輔助治療,可以促進(jìn)其骨折愈合。同時(shí)掌握骨折愈合過程中的分子機(jī)制規(guī)律,有利于找到促進(jìn)骨折修復(fù)與骨重建的藥理靶點(diǎn)。而補(bǔ)腎活血法的治療靶點(diǎn)可能與募集BMSCs遷移至損傷部位相關(guān),所涉及的趨化因子、信號(hào)通路的機(jī)制較多,而MCP-1/CCR2信號(hào)軸及其Wnt5a信號(hào)通路可能調(diào)控BMSCs遷移,著力研究這兩條機(jī)制,能為補(bǔ)腎活血湯促進(jìn)骨折愈合的研究帶來新的前景。二、臨床研究VAS評(píng)分:兩組在治療后的評(píng)分均較同組治療前降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)然而兩組治療后的疼痛評(píng)分結(jié)果沒有差異,差值亦沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);骨折愈合時(shí)間:治療組的骨折愈合時(shí)間較對(duì)照組的縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Bostman評(píng)分:治療組為(28.21±1.19),對(duì)照組為(26.22±1.15),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。三、實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)腎活血湯石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物均能促進(jìn)大鼠BMSCs體外遷移,其中石油醚部位三濃度較空白組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以100μg/mL為最佳(P0.01);Western blot示補(bǔ)腎活血湯石油醚部位促進(jìn)CCR2蛋白,與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,亦以100 μg/mL濃度最佳,與細(xì)胞免疫熒光結(jié)果一致;Western blot和RT-qPCR顯示補(bǔ)腎活血湯石油醚部位能促進(jìn)大鼠BMSCs表達(dá)Wnt5a;RT-qPCR結(jié)果示三段Wnt5a-RNAi慢病毒載體有效抑制Wnt5amRNA表達(dá),鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率約為70%,而Western blot也表明了 Wnt5a-RNAi組較空白組和空載體組的Wnt5a蛋白表達(dá)有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),而Transwell實(shí)驗(yàn)也顯示了 Wnt5a-RNAi組細(xì)胞遷移數(shù)量下降。結(jié)論:一、補(bǔ)腎活血法與骨折愈合關(guān)系密切,分析其中BMSCs遷移的分子機(jī)制,特別是趨化因子和信號(hào)通路,對(duì)于探索骨折愈合的治療靶點(diǎn)有重要的意義。二、補(bǔ)腎活血湯能縮短髕骨骨折術(shù)后的愈合時(shí)間,且改善術(shù)后膝關(guān)節(jié)功能。三、補(bǔ)腎活血湯促BMSCs體外遷移的活性部位為石油醚部位,其機(jī)制可能與刺激MCP-1/CCR2信號(hào)軸相關(guān),及其上調(diào)Wnt5a表達(dá)有關(guān),另外初步認(rèn)為Wnt5a信號(hào)通路與BMSCs體外遷移有密切關(guān)系。
[Abstract]:Objective : To study the mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells ( MSC ) in the treatment of fracture healing . ( 2 ) The expression of Wnt5a protein was detected by Western blot in the active part of Bushen huoxu decoction by Western blot , and the expression of Wnt5a mRNA in each group was observed by real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) . The effects of Wnt5a - RNAi chronic viral vector and negative control virus on the expression of Wnt5a mmRNA were observed in the Wnt5a - RNAi slow virus vector and the negative control virus . Conclusion : The mechanism of invigorating kidney and promoting blood circulation can shorten the healing time after the fracture healing and improve the function of knee joint .

【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R274.9

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本文編號(hào)：1363007