本文關(guān)鍵詞：IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及機制研究

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【摘要】：第一部分IL-23表達(dá)質(zhì)粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建目的:小鼠IL-23融合基因片段的克隆及hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。方法:取小鼠hepa1-6細(xì)胞提取總RNA,通過RT-PCR克隆p19基因的編碼區(qū)和p40基因編碼區(qū)的成熟區(qū);采用重疊延伸PCR的方法,通過編碼一段柔性肽段(Gly4Ser)3的DNA序列連接p19片段和p40片段,構(gòu)建小鼠IL-23單鏈融合基因,添加酶切位點,并將其克隆至p RRL-Venus慢病毒載體中。通過包裝慢病毒感染hepa1-6細(xì)胞,再通過流式分選的方法篩得可以穩(wěn)定表達(dá)IL-23的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。結(jié)果:DNA測序結(jié)果表明:小鼠IL-23融合基因中p19、linker及p40的連接順序、方向及翻譯成氨基酸序列完全正確。結(jié)論:成功克隆小鼠IL-23單鏈融合基因并構(gòu)建其慢病毒質(zhì)粒。成功構(gòu)建可以穩(wěn)定表達(dá)IL-23的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。為進(jìn)一步研究IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及其機制奠定了基礎(chǔ)。第二部分IL-23對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系的生物學(xué)行為的影響目的:體外檢測IL-23對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。方法:通過一系列體外實驗檢測IL-23對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。包括:采用MTT實驗、Ki-67染色實驗檢測IL-23對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生長、增殖的影響;通過Annexin V和7AAD的流式染色檢測IL-23對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響;通過細(xì)胞周期的流式染色檢測IL-23對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響;通過劃痕實驗及transwell實驗檢測IL-23對肝癌細(xì)胞的遷移能力的影響。結(jié)果:MTT實驗和Ki-67染色結(jié)果顯示IL-23促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖;細(xì)胞凋亡的染色結(jié)果表明IL-23不影響肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期的結(jié)果表明IL-23促進(jìn)肝癌細(xì)胞維持在S期和G2期;劃痕實驗和transwell實驗提示IL-23可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。結(jié)論:體外實驗揭示IL-23可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長、增殖和遷移,并且可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞維持在S期和G2期,但是不影響肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。第三部分IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及機制的研究目的:利用小鼠肝癌動物模型探究IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及其可能的機制。方法:(1)構(gòu)建肝癌模型:(a.)取對數(shù)生長期的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞用PBS制成單細(xì)胞懸液(5×105/ml),每只小鼠注射的細(xì)胞量為1×106/2 ml PBS,利用高壓水流動力學(xué)的注射方法在5-8s內(nèi)將細(xì)胞通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。3周后處死小鼠,取出小鼠肝臟,計數(shù)肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù);(b.)提前一周給小鼠喝含抗生素(80000U/250ml)的酸性水。取對數(shù)生長期的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞用PBS制成單細(xì)胞懸液(4×107/ml),每只小鼠注射的細(xì)胞量為1×106/25μl PBS,利用手術(shù)的方法,在超凈工作臺中,將小鼠腹部剖開一小口,擠出肝臟一葉,用胰島素注射器吸取細(xì)胞緩慢的注射入暴露的肝臟中,再將小鼠傷口縫合。2周后處死小鼠,取出小鼠肝臟,測量并計算小鼠腫瘤體積;(c.)取14天大的C57BL/6雄性小鼠,腹腔注射DEN(25mg/kg),于SPF級環(huán)境飼養(yǎng)8-10個月,從第5個月開始,每兩個月采用高壓水流動力學(xué)的方法注射對照及IL-23微環(huán)質(zhì)粒,8個月后處死小鼠,計數(shù)肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)并測量腫瘤體積。(2)通過流式染色檢測荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞后1周的非荷瘤鼠脾臟和肝臟中淋巴細(xì)胞表面CD3、CD4、CD8、CD62L、CD44、CD25、CD127、CD11b、Gr1等marker的陽性率;胞內(nèi)染色檢測荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞后1周的非荷瘤鼠脾臟和肝臟中CD4+T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A以及CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A。利用IL-17A敲基因小鼠重復(fù)HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建肝癌模型的實驗確定IL-17A在IL-23介導(dǎo)的促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用。采用CBA染色探究IL-23對外周血中細(xì)胞因子的影響。結(jié)果:通過不同方法構(gòu)建的肝癌模型表明IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中具有促進(jìn)作用。流式染色結(jié)果表明在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展后期IL-23影響了脾臟和肝臟中MDSC、Treg等抑制性細(xì)胞的所占的比例及IFN-γ、TNF-α和IL-17A的分泌。在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展早期流式染色結(jié)果表示IL-23影響了肝臟中CD4+效應(yīng)T細(xì)胞和CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的比例以及脾臟和肝臟中IL-17A的表達(dá)水平,其中肝臟中分泌IL-17A的主要細(xì)胞是NCR-ILC3細(xì)胞。結(jié)論:IL-23促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)展,其可能的機制為IL-23維持了NCR-ILC3細(xì)胞IL-17A的分泌進(jìn)而影響了脾臟和肝臟中MDSC、Treg細(xì)胞的比例及T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,從而抑制了抗腫瘤免疫反應(yīng)而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：小鼠IL-23 融合基因 重疊延伸PCR 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 MTT實驗 Ki-67 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期 遷移 肝細(xì)胞肝癌 MDSC IL-17A NCR-ILC3
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-15
• 第一部分IL-23 表達(dá)質(zhì)粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建15-34
• 1 引言15-16
• 2 材料與方法16-25
• 2.1 實驗材料16-18
• 2.2 實驗方法18-25
• 3 結(jié)果25-32
• 3.1 小鼠IL-23p19、IL-12p40 基因的擴增與克隆25-26
• 3.2 小鼠IL-23 融合基因的克隆26-29
• 3.3 小鼠pRRL-Venus-IL-23 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建29-30
• 3.4 慢病毒顆粒的包裝、生產(chǎn)和保存30
• 3.5 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建30-32
• 4 討論32-34
• 第二部分IL-23 對肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生物學(xué)影響34-46
• 1 引言34-35
• 2 材料與方法35-39
• 2.1 實驗材料35-36
• 2.2 實驗方法36-39
• 3 結(jié)果39-44
• 3.1 IL-23 可以顯著地促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生長39-40
• 3.2 IL-23 不影響肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的凋亡40-41
• 3.3 IL-23 增加肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞S期和G2 期比例41-42
• 3.4 IL-23 促進(jìn)hepa1-6 細(xì)胞的遷移42-44
• 4 討論44-46
• 第三部分IL-23 在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及機制研究46-70
• 1 引言46-48
• 2 材料與方法48-56
• 2.1 實驗材料48-50
• 2.2 實驗方法50-56
• 3 結(jié)果56-69
• 3.1 IL-23 促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)展56-58
• 3.2 IL-23 增加MDSC和Treg細(xì)胞的比例58-60
• 3.3 IL-23 維持促進(jìn)IL-17A的分泌并抑制TNF-α 的分泌60-64
• 3.4 腫瘤發(fā)生早期IL-23 促進(jìn)ILC3 細(xì)胞分泌IL-17A64-66
• 3.5 IL-17A在IL-23 介導(dǎo)的促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用66-68
• 3.6 IL-23 對血清中細(xì)胞因子的影響68-69
• 4 討論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-77
• 綜述77-86
• 參考文獻(xiàn)80-86
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文86-87
• 附錄87-88
• 致謝88-89

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Wojciech Blonski;David S Kotlyar;Kimberly A Forde;;Non-viral causes of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2010年29期

，

本文編號：987032