本文關(guān)鍵詞：ZNF521對AML生物特性和CD11b對AML預(yù)后作用的影響研究

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【摘要】：第一部分ZNF521過表達(dá)對急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系的作用和機(jī)制研究研究背景急性髓細(xì)胞白血病,又稱急性非淋巴細(xì)胞白血病,是一種起源于骨髓造血干、祖細(xì)胞的惡性程度很高的血液疾病。在我國,急性髓細(xì)胞白血病是成人中最常見的白血病類型,發(fā)病率隨年齡增長而增加,進(jìn)展迅速,自然病程僅為數(shù)月。白血病的發(fā)生是由多種基因異常及表觀遺傳學(xué)改變參與的多步驟過程,其具體的分子機(jī)制十分復(fù)雜,至今仍不能得到清楚闡述。已有大量研究表明,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制異常所導(dǎo)致的骨髓多能造血干細(xì)胞不能分化為功能正常的各系血細(xì)胞,是白血病發(fā)生的重要原因。近年來,鋅指蛋白521(ZNF521)作為一種參與造血調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子,其在造血干細(xì)胞干性維持、調(diào)控造血干細(xì)胞分化方向中的作用逐漸得到重視。更值得關(guān)注的是,在大多數(shù)的AML患者中發(fā)現(xiàn)有ZNF521的高表達(dá)。同時,ZNF521高表達(dá)與特定的基因異常呈顯著正相關(guān),特別是MLL基因重排。這些研究說明,ZNF521可能與白血病的發(fā)生有密切關(guān)系,但其在白血病發(fā)揮怎樣的作用、具體的作用機(jī)制如何還不清楚。因此,深入研究ZNF521對急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和凋亡等表型的影響,明確其下游的分子靶點(diǎn),對于進(jìn)一步闡明急性髓細(xì)胞白血病的發(fā)病原因,豐富其治療手段具有重要的意義。研究目的1.構(gòu)建含人ZNF521基因的重組慢病毒載體p CDH-puro-ZNF521,將其與慢病毒空載體p CDH-puro分別包裝慢病毒,并感染人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562和THP-1,用Western Blot和Real-Time PCR檢測各細(xì)胞系中ZNF521過表達(dá)情況。建立可穩(wěn)定過表達(dá)ZNF521基因的ZNF521-K562和ZNF521-THP-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。同時用p CDH-puro空載體包裝慢病毒建立NC-K562和NC-THP-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作對照組。2.檢測ZNF521過表達(dá)對急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1和K562增殖和凋亡的影響。3.通過檢測ZNF521下游與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的基因,探討ZNF521過表達(dá)對K562、THP-1的增殖和凋亡表型產(chǎn)生影響的可能作用機(jī)制。研究方法1.擴(kuò)增庫存p Tango-zeo-N4Flag-ZNF521質(zhì)粒。通過NCBI查詢ZNF521 cds序列,確認(rèn)p Tango-zeo-N4Flag-ZNF521表達(dá)的是人ZNF521蛋白亞型1。運(yùn)用Vector NTI設(shè)計引物對目的基因片段N4Flag-ZNF521進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物的5’端和3’端分別引入Nhe I、Swa I酶切位點(diǎn),Nhe I、Swa I雙酶切后連接入p CDH-puro慢病毒載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α、挑取陽性克隆,抽提質(zhì)粒并做酶切鑒定,得到p CDH-puro-ZNF521慢病毒質(zhì)粒。將其與p CDH-puro慢病毒載體與包裝質(zhì)粒ps PAX2、p MD 2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,得到含ZNF521基因的慢病毒顆粒及對照慢病毒顆粒。2.將上述得到的Vector、ZNF521慢病毒感染K562及THP-1細(xì)胞。將細(xì)胞分為:Vector-K562,即感染對照組慢病毒的K562細(xì)胞系;ZNF521-K562,即感染含ZNF521基因的慢病毒載體的K562細(xì)胞系;Vector-THP-1,即感染對照組慢病毒的THP-1細(xì)胞系;ZNF521-THP-1,即感染含ZNF521基因的慢病毒載體的THP-1細(xì)胞系。感染時加用2ug/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選,常規(guī)傳代換液,5天后觀察細(xì)胞活力及狀態(tài)以初步確定感染是否成功。同時收集各組細(xì)胞的RNA和蛋白,采用Real Time PCR和Western Blot檢測各組細(xì)胞ZNF521的m RNA及蛋白表達(dá)上調(diào)情況,最終確定感染是否成功。3.用CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒檢測ZNF521過表達(dá)細(xì)胞系與對照組在細(xì)胞增殖上的差異,用Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡的差異。4.應(yīng)用實(shí)時定量PCR及Western Blot檢測ZNF521過表達(dá)細(xì)胞系中c-myc的表達(dá)變化。研究結(jié)果1.成功構(gòu)建含人ZNF521基因的慢病毒載體p CDH-puro-ZNF521,并成功建立可穩(wěn)定過表達(dá)ZNF521基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系ZNF521-THP-1和ZNF521-K562,以及對照組細(xì)胞系Vcetor-K562和Vector-THP-1。2.CCK-8細(xì)胞生長曲線表明,ZNF521過表達(dá)組與對照組相比增殖明顯加快,3.流式檢測表明ZNF521過表達(dá)組與對照組相比凋亡水平無明顯差異。4.ZNF521-THP-1和ZNF521-THP-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中c-myc在m RNA和蛋白水平均表達(dá)上調(diào)。結(jié)論ZNF521過表達(dá)可促進(jìn)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1和THP-1細(xì)胞系的增殖,但對凋亡無明顯影響。其促增殖作用可能是通過調(diào)控c-myc的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。第二部分CD11b表達(dá)水平對急性髓細(xì)胞白血病患者預(yù)后作用的meta分析研究目的評價分化簇抗原CD11b表達(dá)水平對急性髓細(xì)胞性白血病的預(yù)后作用。研究方法采用Cochrane系統(tǒng)評價方法,通過檢索Pub Med,Embase,Cochrane Library,Web of Science和中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)數(shù)據(jù)庫,按照已制定的檢索策略,進(jìn)行文獻(xiàn)篩選、質(zhì)量評價、提取數(shù)據(jù)及薈萃分析,檢索時間截點(diǎn)為2015年7月。以總生存時間(OS)、無病生存時間(DFS)和完全緩解率(CRR)作為評價指標(biāo),采用Revman5.3軟件就CD11b對AML的預(yù)后作用做出較全面合理的評價。研究結(jié)果共納入13個研究,包含2619個受試對象。Meta分析結(jié)果表明,與CD11b陰性患者相比,CD11b陽性AML患者完全緩解率CRR明顯降低(OR=0.44;95%CI,0.25-0.79;p=0.006),總生存時間OS亦明顯降低(HR=0.66;95%CI,0.55-0.80;p0.0001),而兩者在無病生存時間方面無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(HR=0.67;95%CI,0.31-1.48;p=0.32)。而圍繞種族、CD11b陽性臨界值、治療方案、AML分型、樣品制備方法為劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的亞組分析結(jié)果表明,這些因素對CD11b表達(dá)水平對AML預(yù)后作用均無明顯影響。僅納入NOS高評分研究的敏感性分析結(jié)果與總的Meta分析結(jié)果一致。結(jié)論CD11b表達(dá)陽性AML患者相比于CD11b陰性患者預(yù)后更差,同時本meta分析結(jié)果提示CD11b有望成為AML的新的預(yù)后指標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：鋅指蛋白521 急性髓細(xì)胞白血病 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 CD11b 急性髓細(xì)胞白血病 完全緩解率 無病生存時間 總生存時間
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一部分ZNF521過表達(dá)對急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系的作用和機(jī)制研究13-34
• 前言13-16
• 材料與方法16-28
• 結(jié)果28-32
• 討論32-34
• 第二部分CD11b表達(dá)水平對急性髓細(xì)胞白血病預(yù)后作用的系統(tǒng)評價34-57
• 前言34-36
• 材料與方法36-44
• 結(jié)果44-55
• 討論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 文獻(xiàn)綜述 ZNF423 And B-lymphocyte Malignacies64-76
• 參考文獻(xiàn)73-76
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果76-77
• 致謝77

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本文編號：967857