本文關鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子FOXA2生物素標記體系構建及其互作蛋白鑒定

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【摘要】：乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。乳腺癌作為威脅女性健康最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在中國上升趨勢明顯。乳腺癌細胞的生長特性是：能無限生長、具有轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移能力。因此通過對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展作用機制進行深入研究,以期為腫瘤治療方案及臨床耐藥提供新的靶點。生物素Avi-tag技術是指在目的蛋白的N端或C端加上由15個氨基酸(GLND IFEAQKIEWHE)組成的受體肽小標簽,該小標簽可被生物素連接酶BirA特異性識別,并且生物素連接酶可催化生物素轉(zhuǎn)移到靶標蛋白標簽上的賴氨酸殘基上,導致帶有標簽的靶標蛋白在體內(nèi)能被生物素化。該生物素化過程為酶促反應,反應條件溫和,標記特異性強、專一性高,同時由于序列短小,僅僅只有15個氨基酸,對靶標蛋白的構象及活性影響極低。鏈霉親和素可以特異性地與生物素結(jié)合,結(jié)合力強。因此,可在嚴格的洗脫條件下分離出目標蛋白及與其蛋白特異性相互作用的復合體。叉頭框(Forkhead box)家族蛋白被發(fā)現(xiàn)大量的存在于真菌及動物體內(nèi),這個家族的主要特征是作為轉(zhuǎn)錄因子作用于DNA結(jié)合序列,于其DNA結(jié)合區(qū)域序列的極端保守性,并且在這類家族蛋白的尾部具有特殊的翼狀螺旋結(jié)構。FOXA2是Forkhead box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,FOXA2參與胚胎發(fā)育,同時抑制多種腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,并在參與細胞干性維持發(fā)揮重要作用。臨床上發(fā)現(xiàn),在眾多腫瘤樣品如乳腺癌、肺癌等中發(fā)現(xiàn)FOXA2有較高水平的表達,FOXA2高表達或許與細胞的癌變有著密切的關聯(lián)。此外,FOXA2還參與多種信號通路,包括調(diào)控致癌信號多種途徑。這些都暗示轉(zhuǎn)錄因子FOXA2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。蛋白互作研究是后基因組時代一個重要研究內(nèi)容,也是當前非常熱門研究領域。生物體內(nèi),與外界進行信號交換,都是通過配體與細胞表面的跨膜受體結(jié)合,而后通過蛋白-蛋白相互作用層層傳遞至細胞核中引起特定的生理生化反應。生物機體內(nèi)每一個小分子都不是獨立存在的,而是通過與其它物質(zhì)結(jié)合協(xié)同發(fā)揮作用,從而形成一個相互交叉緊密聯(lián)系的網(wǎng)絡�？刂瓢┌Y也不能只抑制單一的信號通路,腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是由多條不同信號通路共同參與、相互影響、相互作用的最終結(jié)果。通過以FOXA2為核心、尋找其互作蛋白,分析信號通路調(diào)節(jié)網(wǎng)絡,對于全面認識FOXA2在細胞中的生物學功能,具有十分重要的價值。本課題構建了基于生物素Avi-tag的FOXA2真核表達載體,利用生物素與鏈霉親和素的高特異性、高親和力的結(jié)合性質(zhì)對FOXA2蛋白進行純化,將所得的蛋白復合體進行考馬斯亮藍染色,質(zhì)譜分析,然后通過生物信息學進行對比分析,尋找FOXA2可能存在的互作蛋白,然后通過免疫共沉淀等分子生物學方法進行驗證,我們在研究中尋找到了FOXA2的互作蛋白FOXP2,并且通過臨床樣品的統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)FOXA2與FOXP2表達水平具有相關聯(lián)性。本研究主要包括兩點：1.建立了轉(zhuǎn)錄因子FOXA2生物素標記體系,實現(xiàn)了FOXA2在乳腺癌細胞中被生物素化,同時實現(xiàn)了且該蛋白Western Blotting、Pull-down等實驗中無需抗體的一步法應用,快速,經(jīng)濟,高效。2.尋找并驗證轉(zhuǎn)錄因子FOXA2的互作蛋白FOXP2,對FOXA2調(diào)控機制與功能的理解更進一步。
【關鍵詞】：生物素化FOXA2 生物素標簽 親和純化 蛋白互作 FOXP2
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-23
• 1.1 乳腺癌概述12
• 1.2 生物素Avi-tag技術概述12-16
• 1.2.1 Avi-tag簡介12-14
• 1.2.2 生物素與生物素連接酶BirA的簡介14-15
• 1.2.3 鏈霉親和素簡介15-16
• 1.3 轉(zhuǎn)錄因子FOXA2概述16-19
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄因子概述16
• 1.3.2 FOX家族概述16
• 1.3.3 轉(zhuǎn)錄因子FOXA2概述16-17
• 1.3.4 轉(zhuǎn)錄因子FOXA2的結(jié)構與分子構象17
• 1.3.5 轉(zhuǎn)錄因子FOXA2的生物學功能17-18
• 1.3.6 轉(zhuǎn)錄因子FOXA2與腫瘤18-19
• 1.4 轉(zhuǎn)錄因子FOXP2概述19-20
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXP2結(jié)構19
• 1.4.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXP2的生物學功能19-20
• 1.5 FOXA2蛋白互作概述20-21
• 1.6 研究目的、內(nèi)容與意義21
• 1.7 本論文的工作設想21-23
• 第2章 生物素化FOXA2真核表達體系的構建23-33
• 2.1 前言23
• 2.2 實驗材料與儀器23-25
• 2.3 實驗方法25-30
• 2.3.1 生物素化FOXA2重組表達質(zhì)粒的構建25-30
• 2.4 結(jié)果與分析30-31
• 2.4.1 pcDNA3.1-Avi-FOXA2重組表達載體的構建及鑒定30-31
• 2.5 本章小結(jié)31-33
• 第3章 生物素濃度及細胞模型的選擇33-42
• 3.1 前言33
• 3.2 實驗材料與儀器33-35
• 3.3 實驗方法35-40
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)35-36
• 3.3.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實驗36-37
• 3.3.3 培養(yǎng)基中添加不同濃度生物素37
• 3.3.4 Western Blotting (WB)37-40
• 3.4 結(jié)果與討論40-41
• 3.4.1 生物素濃度梯度40-41
• 3.4.2 細胞模型的確定41
• 3.5 討論41-42
• 第4章 Avi-FOXA2的生物素化檢測、純化及考馬斯亮藍染色42-48
• 4.1 前言42
• 4.2 實驗材料與儀器42-44
• 4.3 FOXA2及生物素的表達檢測44
• 4.3.1 細胞培養(yǎng)44
• 4.3.2 細胞傳代44
• 4.3.3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實驗44
• 4.4 蛋白純化與電泳44
• 4.4.1 蛋白的純化44
• 4.4.2 蛋白電泳44
• 4.5 考馬斯亮藍染色44-45
• 4.5.1 SDS-PAGE凝膠的配制44-45
• 4.5.2 蛋白樣的制備45
• 4.5.3 電泳45
• 4.5.4 考馬斯亮藍染色45
• 4.6 結(jié)果與分析45-46
• 4.7 本章小結(jié)46-48
• 第5章 Avi-FOXA2質(zhì)譜分析及結(jié)果生物信息學分析48-53
• 5.1 前言48
• 5.2 實驗材料和儀器48-49
• 5.3 實驗方法49-51
• 5.3.1 質(zhì)譜前樣品處理,酶解49-50
• 5.3.2 LTQ質(zhì)譜分析50
• 5.3.3 MS分析50-51
• 5.4 結(jié)果與討論51-53
• 5.4.1 質(zhì)譜分析及生物信息學分析51-52
• 5.4.2 討論52-53
• 第6章 分子生物學FOXA2蛋白互作的驗證53-62
• 6.1 前言53-54
• 6.2 實驗材料與儀器54-56
• 6.3 實驗方法56-59
• 6.3.1 pcDNA3.1-his-FOXP2重組質(zhì)粒的構建與鑒定56-58
• 6.3.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實驗58
• 6.3.3 蛋白免疫印跡法(WB)58-59
• 6.3.4 蛋白純化59
• 6.3.5 免疫共沉淀驗證互作蛋白59
• 6.4 結(jié)果與分析59-61
• 6.4.1 pcDNA3.1-his-FOXP2重組表達載體的構建及鑒定59-60
• 6.4.2 免疫共沉淀FOXA2互作蛋白的驗證60-61
• 6.5 討論61-62
• 第7章 臨床樣本中轉(zhuǎn)錄因子FOXP2與FOXA2表達量具有的相關性62-65
• 7.1 前言62
• 7.2 實驗材料與儀器62-63
• 7.3 實驗方法63-64
• 7.3.1 臨床組織樣本中蛋白的提取63
• 7.3.2 Western Blotting (WB)63
• 7.3.3 統(tǒng)計分析63-64
• 7.4 結(jié)果與討論64-65
• 7.4.1 乳腺癌臨床樣本中FOXA2與FOXP2蛋白的表達情況64
• 7.4.2 討論64-65
• 總結(jié)與展望65-67
• 1.結(jié)論65
• 2展望65-67
• 參考文獻67-73
• 附錄A 英文縮寫73-74
• 附錄B 常用緩沖液和試劑配方74-75
• 附錄C 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文目錄75-76
• 致謝76-77
• 附錄D 英文縮寫77-78
• 附錄E 常用緩沖液和試劑配方78-79

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本文編號：941949