本文關(guān)鍵詞：靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3-預(yù)定位法檢測肝細(xì)胞癌的MRI研究

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【摘要】：背景與目的：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)惡性程度高,被譽為“癌中之王”,在全球常見癌癥中居第五位,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其預(yù)后極差,在未做積極治療的患者中,中位生存期僅有8個月。但患者如能在HCC的早期階段得到積極治療,預(yù)后可以得到明顯的改善。因此,從臨床方面看,早期診斷將明顯提高肝細(xì)胞癌的手術(shù)治療作用,也是提高其預(yù)后的關(guān)鍵之一。臨床上,MRI掃描是診斷HCC的常用方法,但是HCC在磁共振診斷技術(shù)中具有較明顯的不典型性,特別是由肝硬化發(fā)展而來的HCC,更容易受多種局灶性結(jié)節(jié)病變的影響,這降低了HCC的確診率。而常用對比劑由于缺乏對HCC進(jìn)行特異性地診斷,很難在早期鑒別腫瘤。近年來,分子影像技術(shù),特別是磁共振方面的分子影像,通過高親和性的分子探針,利用高特異性的靶向結(jié)合作用,能夠敏感快速地探測到靶向病灶,并可以從分子層面分析病灶。因此分子影像可望成為實現(xiàn)肝細(xì)胞癌早期診斷有力工具。在肝細(xì)胞癌磁共振分子影像中,分子靶點以及配體的選擇關(guān)系到診斷的敏感性及特異性。研究發(fā)現(xiàn)在HCC中,磷酯酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)蛋白在肝癌細(xì)胞表面過度表達(dá)并具有很高的特異性,動物實驗表明以GPC3作為靶點的單克隆抗體介導(dǎo)的MR免疫成像能夠檢測出微小的HCC癌灶。在配體選擇方面,抗體是使用最廣泛的,但以單克隆抗體作為配體,存在的局限性不僅是價格昂貴、具有致免疫性,并且更為重要的是,抗體的高分子量會導(dǎo)致較差的組織穿透力,進(jìn)行體內(nèi)研究時會明顯減弱其靶向作用。所以與抗GPC3單克隆抗體相比,L5多肽具有相同的靶向性能但其分子量小、價格低廉且無免疫源性。在成像方式方面,為了提高對比增強作用,引入生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS)。此系統(tǒng)具有高親和性及高特異性,并易于結(jié)合多種標(biāo)記物而不影響其功能。對比起直接靶向法,BAS能明顯地提高靶向組織的對比劑攝取量。因此,本文應(yīng)用L5多肽作為靶向GPC3蛋白的配體,將與聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)結(jié)合的超小超順磁性氧化鐵(ultra-small superparamagnetic iron oxide, USPIO)作為對比劑,并應(yīng)用生物素-親和素預(yù)定位系統(tǒng),進(jìn)行HCC磁共振分子成像。研究內(nèi)容及方法：1.采用直接免疫熒光檢測L5多肽與肝癌細(xì)胞的結(jié)合情況：通過收集對數(shù)生長期HepG2肝癌細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞HL-7702并計數(shù),以每孔5×105分別接種在六孔板,各設(shè)3個復(fù)孔,37℃培養(yǎng)過夜；用無血清培養(yǎng)基配制0.1 mg/mlL5-FAM溶液,然后去除六孔板內(nèi)培養(yǎng)液,PBS液洗滌,加入2 ml L5-FAM溶液至每個孔中,37℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育2h；用PBS液洗滌,去除未結(jié)合熒光多肽,加入4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞,用PBS洗滌,然后滴加熒光抗淬滅劑,然后置于倒置熒光顯微鏡觀察,并用FAM溶液作對照進(jìn)行實驗。2.L5多肽與肝細(xì)胞癌的結(jié)合抑制實驗檢測結(jié)合的特異性：選擇HepG2作為研究對象,先將濃度為1 mg/ml的未標(biāo)記FAM的L5多肽加入培養(yǎng)板六孔板中的各孔,孵育1h,隨后加入0.1 mg/ml的FAM-L5避光孵育2h；清洗、固定后,觀察熒光表達(dá)。3.免疫熒光法檢測HepG2肝癌細(xì)胞GPC3表達(dá)驗證：選擇HepG2作為研究對象,計數(shù)、鋪板后,4%多聚甲醛固定,用稀釋后的抗GPC3一抗(5%BSA以1：100稀釋)于4℃中孵育過夜；洗滌后,用FITC標(biāo)記的二抗標(biāo)記上述一抗；洗滌后,觀察熒光表達(dá)。4.通過酰胺反應(yīng)合成鏈霉親和素化PEG-USPIO:取5 ml 0.1 mol/L MES緩沖液(pH 6.0)溶解的PEG-USPIO (1 mg Fe/ml),加入2.0 mg EDC和5.5 mgsulfo-NHS,室溫下?lián)u床振蕩15 mmin以充分反應(yīng)；②加入7.0μl2-巰基乙醇來阻斷EDC反應(yīng)；③超濾離心管離心除去還原劑和阻斷劑,漂洗3次,重懸在PBS緩沖液(pH 7.4)中；④加入3 mg SA,室溫?fù)u床振蕩2 h；⑤加入終濃度為30 mM的乙醇胺終止反應(yīng)；⑥超濾離心管離心除去多余的SA和阻斷劑,漂洗,純化好的合成物重懸在PBS (pH7.4)中,調(diào)節(jié)濃度為1 mg Fe/ml。并將所制備制劑用DMEM培養(yǎng)基及1640培養(yǎng)基稀釋溶解,存放在4㈧環(huán)境中,以測試其穩(wěn)定性。5.通過激光粒度分析儀測定PEG-USPIO和SA-PEG-USPIO的粒徑及電位：吸取15μ]制備的相應(yīng)樣品,用去離子水稀釋至離心管,終濃度為0.6 mmol/L,采用Malven-3000HS激光粒度分析儀測定Zeta電位和粒徑及其分布,所選激光光源波長為633.0 nm,測試溫度為25.00±0.05℃,光信號用256通道、高速數(shù)字相關(guān)器進(jìn)行處理。6.測定PEG-USPIO和SA-PEG-USPIO的T2弛豫率：取20支5 ml試管,分兩組,各10支,第一組每管分別裝Fe濃度為0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.2、0.4、0.6 mM的PEG-USPIO 5 ml,第二組為SA-PEG-USPIO,濃度梯度同前。采用T2 mapping(運用反轉(zhuǎn)恢復(fù)快速自旋回波技術(shù))序列對各管進(jìn)行橫斷成像,4個回波,TE分別為20、40、60、80 ms, TR為2000 ms, NEX為4,FOV為75×75 cm,層厚2 mln,層間隔2 mm. T2 mapping原始數(shù)據(jù)使用Functool軟件包的T2 mapping分析軟件,計算每個試管ROI的T2值,選取三個層面,取其平均值,以鐵濃度為橫坐標(biāo),1/T2為縱坐標(biāo)作直線回歸方程,所得斜率為T2弛豫率。7.采用MTT法體外評價SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO的細(xì)胞毒性：HL-7702正常肝細(xì)胞接種于96孔板中,37℃,5%CO2條件下過夜,分別加入含有PEG-USPIO和L5-PEG-USPIO的培養(yǎng)基(每孔的鐵濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mmol/L),每組設(shè)3個復(fù)孔,其中以僅含培養(yǎng)基的孔作為調(diào)零孔,以僅含正常細(xì)胞及培養(yǎng)基的孔作為對照孔；37℃,5%C02條件下培養(yǎng)24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液,每孔加150μLDMSO,置于平板振蕩儀上振蕩10 min；置于酶標(biāo)儀上,在490 nm波長處測定OD值(吸光度值)；計算細(xì)胞存活率并分析樣品細(xì)胞毒性。并利用析因設(shè)計法及單因素方差分析,考察兩個處理因素對細(xì)胞毒性的影響差異。8.普魯士藍(lán)染色驗證L5-BT介導(dǎo)下SA-PEG-USPIO與HepG2的結(jié)合能力：HepG2和HL-7702各接種在12孔板,并選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗,各分為3組：L5-BT/SA-PEG-USPIO組：先加入0.2 mg/ml的L5-BT,孵育2 h,洗滌3遍后,加入Fe濃度為1.8 mmol/L的SA-PEG-USPIO,孵育2 h;SA-PEG-USPIO組：直接加入Fe濃度為1.8 mM的SA-PEG-USPIO,孵育2 h；未加藥物組。每組設(shè)6個復(fù)孔;普魯士染色：清洗,固定,用普魯士藍(lán)反應(yīng)液染色,后用0.5%核固紅復(fù)染,清洗后置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。9.體外MR成像觀察：相應(yīng)試劑孵育后的細(xì)胞消化、離心后重懸于2 ml 1%瓊脂糖離心管中,行MR掃描。采用T2 mapping序列成像,以獲得T2值偽彩圖；T2WI FSE序列(快速自旋回波序列),TR=2500 ms, TE=96 ms, NEX為4,FOV為75÷75 cm,層厚2 mm,層間隔2 mm,圖像采集后計算每個試管ROI的T2信號強度,選取三個層面,取其平均值,并以相同濃度空白瓊脂糖的信號強度為標(biāo)準(zhǔn),對每個試管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。10.體內(nèi)MR成像觀察：肝細(xì)胞癌移植瘤模型在預(yù)定位組中經(jīng)尾靜脈注射生物素化多肽L5,腹腔注射鏈霉親和素再經(jīng)尾靜脈注射SA-PEG-USPIO探針,采用3.0T磁共振掃描儀進(jìn)行T2WI SE序列成像,并以尾靜脈注射PEG-USPIO作為對照組：掃描后取腫瘤組織進(jìn)行普魯士藍(lán)染色及免疫組化分析,以探討L5介導(dǎo)預(yù)定位法磁共振成像對HCC的靶向增強作用。結(jié)果：1.免疫熒光實驗顯示多肽L5出現(xiàn)在HepG2細(xì)胞表面以及胞質(zhì)內(nèi),而HL-7702細(xì)胞只有少許熒光顯示,且FAM的孵育也只是出現(xiàn)微量的熒光。抑制實驗中可以看到HepG2細(xì)胞內(nèi)的熒光信號明顯減弱甚至消失；并且絕大部分HepG2表面以及胞質(zhì)內(nèi)均有較為明顯的熒光表達(dá)。HepG2肝癌細(xì)胞GPC3受體陽性表達(dá)染色。2. SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO溶液均呈黑色,前者水合直徑為(35.97±5.19)nm,分散系數(shù)(PdI)為(0.17±0.05),Zeta電位為(-7.91±1.22)mV,后者直徑為(22.73+3.31)nm,分散系數(shù)為(0.21±0.02),Zeta電位為(4.22±0.53)mV。兩者分散系數(shù)均較低(0.2左右),說明兩者在水溶性條件下粒徑較為均勻,未出現(xiàn)明顯聚集。兩種試劑在PBS及兩種培養(yǎng)基溶液中稀釋存放6個月,均未見明顯沉淀。隨著SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO鐵濃度的增加,T2值逐漸下降,1/T2值相應(yīng)上升；兩者的T2弛豫率分別為0,1039×103和0.1394×103 mM-1s-1。3.MTT法測定結(jié)果顯示隨著Fe濃度的增加,兩實驗組的HL-7702細(xì)胞的存活率有所下降,但存活率均可達(dá)到80%以上,并且從所得數(shù)據(jù)作出回歸曲線可得出SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO的半數(shù)抑制量分別為9.36和8.97 mM,這提示SA-PEG-USPIO和PEG-USPIO在體外實驗所需的Fe濃度區(qū)間內(nèi)為低毒性,能用于后續(xù)實驗。4.體外實驗的普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示,L5-BT/SA-PEG-USPIO組中HepG2細(xì)胞的胞膜胞質(zhì)內(nèi)可見大量藍(lán)染鐵顆粒,部分呈聚集狀態(tài)。而在HepG2細(xì)胞的SA-PEG-USPIO組以及HL-7702細(xì)胞各組中,只出現(xiàn)少許的藍(lán)染鐵顆粒。5.體外MR成像顯示,L5-BT/SA-PEG-USPIO組中HepG2細(xì)胞的T2信號明顯低于其他各組。通過標(biāo)準(zhǔn)化T2WI信號強度的數(shù)據(jù),采用多組獨立樣本單因素方差分析以及SNK兩兩比較的統(tǒng)計學(xué)方法可以得出L5-BT/SA-PEG-USPIO組、SA-PEG-USPIO組中HL-7702細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化T2WI信號強度以及SA-PEG-USPIO組中HepG2細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化T2WI信號強度分別為69.00±11.07、78.22±8.41和76.91±12.30,而L5-BT/SA-PEG-USPIO組中HepG2細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化T2WI信號強度是38.80±7.19,各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.96,P0.01),通過兩兩比較可得出,HepG2細(xì)胞的L5-BT/SA-PEG-USPIO組與前三者的標(biāo)準(zhǔn)化T2M信號強度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),代表著預(yù)定位實驗組特異性地改變了HepG2細(xì)胞的成像。6.裸鼠移植瘤體內(nèi)磁共振成像顯示移植瘤的T2WI信號強度在10min時降至最低,預(yù)定位組的移植瘤信號開始緩慢上升,在2h、4h及6h的圖像中,信號升高程度縮小,但在對照組中,1h及1h后的圖像可見到移植瘤的信號回升到平掃前的信號強度。普魯士藍(lán)染色顯示腫瘤細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間隙大量的藍(lán)染顆粒,GPC3免疫組化染色顯示相應(yīng)區(qū)域細(xì)胞高表達(dá)GPC3。相對信號強度-時間曲線圖可清晰地看到預(yù)定位增強組在10 min時,信號達(dá)最低,并緩慢升高后進(jìn)入平臺期,信號改變不明顯,而對照組在10 min時達(dá)到最低值后,信號從1h開始回升到平掃的狀態(tài)。在1h、2h、4h及6h時間點,預(yù)定位增強組與對照組感興趣區(qū)的相對信號強度的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：在本實驗中,我們通過多肽介導(dǎo)的二步預(yù)定位方法,應(yīng)用PEG修飾的納米級對比劑,初步實現(xiàn)HCC的主動靶向MR成像。
【關(guān)鍵詞】：多肽 肝細(xì)胞癌 磁共振成像 分子探針
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R445.2;R735.7
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-27
• 參考文獻(xiàn)23-27
• 第一章 L5多肽的靶向性驗證27-34
• 1 目的27
• 2 材料與方法27-30
• 3 結(jié)果30-31
• 4 討論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二章 鏈霉親和素化超順磁性磁共振對比劑的制備及體外表征34-51
• 1 目的34
• 2 材料與方法34-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 第三章 L5-BT介導(dǎo)鏈霉親和素化超小超順磁性磁共振對比劑的MR成像評價51-71
• 1 目的51
• 2 材料與方法51-57
• 3 結(jié)果57-63
• 4 討論63-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 中英文對照縮略詞表71-72
• 攻讀學(xué)位期間成果72-73
• 致謝73-74

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉天輝;常剛;曹瑞軍;孟令杰;;超順磁性Fe_3O_4納米粒子在磁共振造影中的應(yīng)用[J];化學(xué)進(jìn)展;2015年05期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李強;鐵基納米材料的制備及其與蛋白質(zhì)的相互作用性質(zhì)研究[D];華中師范大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 王志濤;水溶性磁性納米粒子的制備及其對核磁共振成像影響的研究[D];吉林大學(xué);2013年

2 李永記;磁性納米材料去除水中有毒污染物的應(yīng)用研究[D];西南大學(xué);2013年

3 徐鳳;金磁復(fù)合微粒的制備及在氯霉素檢測中的應(yīng)用探討[D];上海師范大學(xué);2013年

4 葉楠;弱堿性Fe_3O_4水基磁流體的制備與穩(wěn)定機理研究[D];南昌大學(xué);2013年

5 蔣力維;功能化磁性粒子—高效液相色譜分離分析體液中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[D];湖南師范大學(xué);2014年

6 胡雨辰;納米零價鐵/介孔碳復(fù)合體的制備及其還原性能的研究[D];黑龍江大學(xué);2014年

7 陳梅玉;磁性納米氧化鐵修飾的高三尖杉酯堿對白血病細(xì)胞的體內(nèi)外效應(yīng)研究[D];蘇州大學(xué);2014年

8 余玲;阿爾茨海默病與大腸癌早期診斷的分子光譜新方法及藥物篩選[D];中南大學(xué);2014年

9 蔚丹丹;shRNA靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因轉(zhuǎn)錄對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用[D];南通大學(xué);2013年

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本文編號：917161