本文關(guān)鍵詞：EMMPRIN在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化過程中的作用及機制研究

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【摘要】：背景和目的:肺癌是當(dāng)今全球癌癥死亡的主要原因之一。根據(jù)生物學(xué)特點、治療方式及預(yù)后等可將肺癌主要分為兩大類:非小細胞肺癌與小細胞肺癌,其中以非小細胞肺癌為主。非小細胞肺癌占85%以上,而其中約30%-40%的非小細胞肺癌患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。目前對于肺癌骨轉(zhuǎn)移的機制研究并不清楚。研究比較深入的為“惡性循環(huán)”學(xué)說,一方面,轉(zhuǎn)移至骨的腫瘤細胞表達、分泌眾多細胞因子,作用于骨微環(huán)境,破壞了成骨細胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收之間的正常生理平衡;另一方面,骨質(zhì)的破壞也會釋放一系列因子,促進腫瘤細胞的生長、侵襲等。肺癌骨轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致一系列包括骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫和神經(jīng)壓迫癥狀等在內(nèi)的嚴(yán)重并發(fā)癥,降低患者的生活質(zhì)量。細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(Extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN),又稱CD147,是一種高度糖基化的跨膜糖蛋白,為免疫球蛋白超家族一員,能刺激多種基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinases,MMPs)的表達,促進腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移,并能夠通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達,從而誘導(dǎo)腫瘤血管生成。業(yè)已證實,EMMPIN的高表達與乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。最近有文獻報道通過上調(diào)EMMPRIN的表達,可加速“惡性循環(huán)”,激活破骨細胞,增強乳腺癌的溶骨性轉(zhuǎn)移,但EMMPRIN對肺癌細胞介導(dǎo)的成骨細胞分化成熟是否起作用并不清楚。本研究旨在研究EMMPRIN在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化中的作用及可能機制,為臨床肺癌骨轉(zhuǎn)移防治開辟新的思路。研究方法:我們采用EMMPRIN過表達、短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒感染非小細胞肺癌A549細胞,建立穩(wěn)定的相應(yīng)A549細胞系。首先,觀察其對非小細胞肺癌A549細胞自身的增殖、遷移與侵襲等生物學(xué)行為的影響,并探討其可能機制。而后,收集相應(yīng)的肺癌細胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM),與成骨前體細胞mc3t3-e1共培養(yǎng),觀察其對成骨前體細胞mc3t3-e1成骨分化的影響。最后,我們檢測其對肺癌a549細胞自身的dkk1的表達的影響,并進一步檢測成骨前體細胞mc3t3-e1內(nèi)wnt/β-catenin信號通路β-catenin活化的情況。一、emmprin對肺癌a549細胞增殖、遷移與侵襲的影響1.用shrna干擾emmprin表達的慢病毒、過表達emmprin的慢病毒及陰性對照(negativecontrol,nc)的慢病毒感染肺癌a549細胞,嘌呤霉素篩選。利用realtimepcr技術(shù)、western-blot蛋白印跡法分別檢測各組細胞emmprin的mrna、蛋白表達情況。建立穩(wěn)定emmprin過表達(a549emp)、干擾emmprin表達(a549shemp)和陰性對照a549nc細胞。采用cck-8實驗、劃痕實驗及transwell小室法分別檢測emmprin對肺癌a549細胞增殖、遷移與侵襲能力的影響。2.利用western-blot蛋白印跡法檢測a549emp細胞、a549shemp細胞、a549nc細胞與空白對照a549細胞中的β-catenin核表達情況。二、emmprin在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化中的作用機制研究收集a549emp細胞、a549shemp細胞、a549nc細胞與空白對照a549細胞條件培養(yǎng)基,以20%條件培養(yǎng)基的含量制備相應(yīng)不同組成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,并與成骨前體細胞mc3t3-e1共培養(yǎng)。1.利用bcip/nbt染色法檢測相應(yīng)各組mc3t3-e1細胞alp活性;2.利用茜素紅s染色檢測相應(yīng)各組mc3t3-e1細胞骨結(jié)節(jié)礦化形成情況;3.利用realtimepcr技術(shù)檢測相應(yīng)各組mc3t3-e1細胞col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna的相對表達量;4.利用realtimepcr技術(shù)、western-blot蛋白印跡法及細胞免疫熒光法檢測相應(yīng)各組肺癌a549細胞dkk1表達的差異情況;5.利用western-blot蛋白印跡法檢測相應(yīng)各組mc3t3-e1細胞中的β-catenin核表達的差異情況。實驗結(jié)果:一、emmprin對肺癌a549細胞增殖、遷移與侵襲能力的影響1.穩(wěn)定的肺癌a549細胞系的成功建立與a549nc組、空白對照a549組相比,a549emp組細胞emmprin的mrna和蛋白表達水平均明顯升高(p0.05),相反,a549shemp組細胞的emmprin的mrna和蛋白表達水平均明顯降低(p0.05);a549nc組與空白對照a549組相比,emmprinmrna和蛋白表達水平無明顯差異(p0.05)。2.emmprin可增強肺癌a549細胞增殖、遷移與侵襲的能力1)與空白對照a549組相比,a549emp組細胞增殖、遷移與侵襲能力明顯增強(p0.05),而a549shemp組細胞增殖、遷移與侵襲能力能力明顯降低(p0.05).2)上調(diào)emmprin的表達,可明顯促進a549細胞β-catenin核表達,反之下調(diào)emmprin的表達,可明顯抑制a549細胞β-catenin核表達;二、emmprin在肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化中作用機制的研究1.干擾emmprin表達可減弱肺癌a549細胞條件培養(yǎng)基(cm)介導(dǎo)的抑制成骨分化的能力:1)alp活性:與陽性對照組相比,a549shempcm組、a549nccm組及a549cm組mc3t3-e1細胞alp活性均明顯減弱;而相比于a549cm組,a549shempcm組mc3t3-e1細胞alp活性明顯增強,a549nccm組alp活性無明顯差異。2)礦化:與陽性對照組相比,a549shempcm組、a549nccm組及a549cm組mc3t3-e1細胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積明顯減小;而相比于a549cm組,a549shempcm組mc3t3-e1細胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積明顯增大(p0.05),a549nccm組mc3t3-e1細胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、面積無明顯差異(p0.05)。3)成骨相關(guān)基因表達:與陽性對照組相比,a549shempcm組、a549nccm組及a549cm組mc3t3-e1細胞成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna表達水平明顯降低(p0.05);而相比于a549cm組,a549shempcm組mc3t3-e1細胞成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna表達水平明顯增高(p0.05),a549nccm組mc3t3-e1細胞成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因col1α1、runx2/cbfa1和ocnmrna表達水平無明顯差異(p0.05)。2.emmprin可通過影響肺癌a549細胞dkk1的表達,影響成骨前體細胞β-catenin的活化,參與肺癌a549條細胞件培養(yǎng)基(cm)介導(dǎo)的成骨抑制作用1)dkk1的表達:干擾emmprin的表達可顯著下調(diào)肺癌a549條細胞及肺癌a549條件培養(yǎng)基中dkk1的mrna和蛋白水平(p0.05),相反,過表達emmprin可顯著上調(diào)肺癌a549條細胞及肺癌a549條件培養(yǎng)基中dkk1的mrna和蛋白水平(p0.05);2)mc3t3-e1細胞內(nèi)β-catenin核表達:a549shempcm組、a549nccm組及a549cm組mc3t3-e1細胞內(nèi)β-catenin核表達水平明顯低于陽性對照組(p0.05),而相比于a549cm組,a549shempcm組mc3t3-e1細胞內(nèi)β-catenin核表達水平明顯增高(p0.05);a549empcm組mc3t3-e1細胞內(nèi)β-catenin核表達水平與A549shEMPCM組剛好相反,即相比于A549CM組,A549EMPCM組成骨前體細胞內(nèi)β-catenin核表達水平明顯增高(P0.05);A549NCCM組與A549CM組相比,MC3T3-E1細胞內(nèi)β-catenin核表達水平無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:一、EMMPRIN可增強肺癌A549細胞增殖、遷移及侵襲的能力,其機制可能與β-catenin的活化有關(guān)。二、EMMPRIN可通過下調(diào)肺癌A549細胞DKK1的表達,抑制成骨前體細胞β-catenin的活化,參與肺癌A549條細胞件培養(yǎng)基(CM)介導(dǎo)的成骨抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：肺癌 CD147 細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子 Wnt/β-catenin DKK1 骨轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 EMMPRIN對肺癌A549細胞增殖、遷移與侵襲能力的影響16-31
• 2.1 材料與方法16-26
• 2.2 結(jié)果26-29
• 2.3 討論29-31
• 第三章 EMMPRIN通過下調(diào)DKK1的表達參與肺癌介導(dǎo)的抑制成骨分化31-45
• 3.1 材料與方法32-38
• 3.2 結(jié)果38-43
• 3.3 討論43-45
• 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻46-51
• 文獻綜述CD147與腫瘤及骨轉(zhuǎn)移的研究進展51-60
• 參考文獻55-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章60-61
• 致謝61

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張偉;馮燕;金榕兵;李清;羅皓;楊雪琴;戴楠;鄒華;王東;單錦露;;基于PET/CT的Ⅳ期肺癌轉(zhuǎn)移特點的臨床分析[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2015年06期

2 李銀鵬;石芳;楊婧;劉政;;肺癌患者血清和胸水中Dickkopf-1的表達及臨床意義[J];河北醫(yī)藥;2015年06期

3 牛玉捷;信波;龐海林;劉樂樂;申煒煒;張賀龍;;下調(diào)ZEB-1表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移與侵襲的影響[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2015年13期

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本文編號：889158